Modelo de cocultivo utilizando dos tipos de líneas celulares adherentes

Resumen

El protocolo muestra un novedoso modelo experimental in vitro que puede recapitular la biología de dos tipos de líneas celulares adherentes con un andamio impreso en tres dimensiones (3D). Se describe la construcción de este modelo y los procedimientos operativos, desde la preparación y el cultivo celular hasta el análisis y la evaluación.

Resumen

La implantación embrionaria se ve afectada por las interacciones entre los diferentes tipos de células en la interfaz madre-embrión. Las comunicaciones directas e indirectas entre los distintos tipos de células dentro de la decidua son cruciales para regular la receptividad endometrial; Sin embargo, los mecanismos moleculares que median esta interacción aún no están claros. En este sentido, se necesita un modelo que estudie el proceso de implantación para establecer un modelo integral in vitro que pueda recapitular la biología de la interacción epitelio-estroma endometrial. Este modelo se compone de placas de cultivo celular regulares y un andamio correspondiente, que se genera mediante impresión tridimensional (3D) a partir de materiales de bajo costo. Aquí, detallamos un conjunto de protocolos para la construcción de modelos, la preparación de células, la siembra de células, el cultivo de células, la observación y la evaluación. Además, hemos incluido resultados representativos con células que exhiben buenas condiciones de crecimiento bajo el microscopio. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar modelos in vitro que imitaran la interacción entre las células estromales endometriales y las células epiteliales, así como entre las células trofoblásticas y las células endometriales.

Introducción

A pesar de la amplia investigación sobre el embarazo humano, los mecanismos moleculares en la interfaz materno-fetal durante la implantación y el embarazo temprano siguen siendo poco conocidos¹. El endometrio humano está compuesto principalmente por dos tipos de células: células epiteliales endometriales (EEC) y células estromales endometriales (ESC). La implantación progresa a través de tres etapas: aposición, unión e invasión, que conducen al desarrollo de un embrión competente y un endometrio receptivo². Teniendo en cuenta las limitaciones éticas de los estudios in vivo en seres humanos, así como las dificultades para simular completamente la condición humana en animales, la construcción de modelos de cultivo de endometrio humano in vitro se ha convertido en un medio eficaz para replicar los procesos de implantación y embarazo temprano³. Estos modelos son valiosos en la investigación de embarazos normales y patológicos y proporcionan una plataforma fundamental para las pruebas preliminares y la validación de intervenciones terapéuticas en medicina traslacional.

Las cámaras comerciales han sido ampliamente utilizadas en la investigación de biología celular. Estas cámaras ofrecen información valiosa sobre la migración celular y la diafonía entre los diferentes tipos de células. Sin embargo, las cámaras comerciales suelen ser de un solo uso y pueden ser costosas⁴.

Se ha desarrollado un gran número de modelos de cultivo humano in vitro que consisten en endometrio y blastocisto, o sustitutos de blastocisto, para comprender mejor el proceso detallado de implantación. Estos modelos, sin embargo, aún se encuentran en su etapa inicial de aplicación, ya que la estructura 3D es una configuración experimental muy complicada y ciertos medios de diferenciación específicos son costosos ^5,6,7.

El uso de hardware de impresión 3D asequible y un período de fabricación relativamente corto permite adaptar las estructuras a diferentes propósitos experimentales. Las técnicas de impresión 3D ayudan a reducir los costes de tiempo y permiten la creación de estructuras complejas y personalizadas. Esta tecnología acelera significativamente el diseño y la iteración de prototipos, lo que la convierte en una herramienta valiosa para los investigadores de diversos campos, permitiéndoles completar su trabajo de manera más eficiente ^8,9,10.

Aquí, presentamos un protocolo experimental factible y económico para la construcción de la estructura 3D y su uso como sistema de cultivo celular, que puede simular la interacción entre células estromales y epiteliales endometriales para la investigación de la receptividad endometrial durante la implantación embrionaria. Esto proporciona una alternativa personalizable y de bajo costo para el material desechable comercial.

Protocolo

NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. A menos que se especifique lo contrario, todos los medios se preequilibraron a 37 °C antes de su uso.

1. 3D impresión del andamio y construcción del modelo

NOTA: Los pasos aquí se realizaron de acuerdo con el libro de manual de la máquina comercial de impresión 3D de metal. Los pasos se describen brevemente a continuación (Archivo complementario 1).

1. Nivelación de la cama de impresión
   1. Toque el icono Menú en el panel y vaya a Utilidades. Seleccione Nivel de cama para iniciar la rutina de nivelación.
   2. Retire la hoja de impresión de la cama de impresión y seleccione Listo. La cama de impresión ascenderá a su altura máxima en preparación para la nivelación. Una vez que la barra de progreso alcance el 100%, presione Inicio.
   3. Si la impresora Metal X no se ha nivelado previamente, seleccione Restablecer. Si es así, elija Omitir y continúe directamente con el paso 1.1.5 (el escaneo de 16 puntos).
   4. Utilice una llave hexagonal de 2,5 mm para girar todos los tornillos de nivelación de tres camas en el sentido de las agujas del reloj hasta que estén apretados. Luego, aflójelos girando en sentido contrario a las agujas del reloj dos rotaciones completas para colocarlos a una altura de punto medio. Presione Listo para continuar.
   5. La impresora escaneará la cama en 16 puntos designados. Absténgase de tocar la cama o el marco durante este proceso. Una vez que el progreso alcance el 100%, presione Siguiente.
2. Aplicación de hoja de impresión
   1. Retire cualquier residuo de metal o residuo de soporte. Mueva el control deslizante Vacío a Activado.
   2. Deje que la cama baje y se caliente, luego presione Siguiente. Coloque la hoja de impresión sobre la rejilla de vacío y presione Siguiente.
   3. Coloque la prensa de hojas sobre la hoja de impresión, alineándola con los rieles en Z en la parte posterior de la cámara.
   4. Espere a que la aspiradora se enganche y cree un sello estable. Una vez que la aspiradora esté activada, presione Listo.
3. Carga de filamentos metálicos
   1. Coloque manualmente el cabezal de impresión en el centro del área de impresión. Retire la cubierta del cabezal de impresión deslizándola hacia arriba y quitándola de los tornillos de montaje.
   2. Toque el icono Menú en el tablero de opciones. Seleccione Materiales en las opciones.
   3. Elija Cargar metal para iniciar la rutina de carga. Elija Carga rápida.
   4. Seleccione el tipo específico de material metálico que se cargará (por ejemplo, Aluminio 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Coloque el carrete en el soporte y presione Siguiente. Cierre la puerta y deje que los carretes se calienten, luego presione Siguiente.
   6. Inserte el material en la entrada frontal del cabezal de impresión (etiquetado como M) hasta que el extrusor comience a arrastrarlo.
4. Impresión de piezas metálicas
   1. En el panel Configuración de impresión, haga clic en Exportar edificiod. Guarde el archivo en una unidad USB formateada en FAT32 e insértelo en la impresora.
   2. Selecciona el icono Menú en el tablero. Vaya a Almacenamiento y seleccione Imprimir desde almacenamiento. Elija el archivo de pieza para comenzar la impresión.
5. Extracción de piezas metálicas
   1. Deslice con cuidado la hoja de impresión y las piezas impresas fuera de la cama de impresión. Separe suavemente las piezas de la hoja de impresión. La lámina flexible debe despegarse con facilidad.

2. Preparación para el cocultivo celular en el modelo 3D

NOTA: Se recomienda que se utilicen materiales resistentes a altas temperaturas como consumibles para la impresión 3D de soportes de andamios de cubreobjetos de celdas para facilitar la esterilización en autoclave antes de cada uso en experimentos de cultivo celular. En este estudio se utilizaron células estromales endometriales humanas inmortalizadas (HESC) y células epiteliales endometriales humanas (Ishikawa). La caracterización de estas líneas celulares ha sido reportada previamente ^5,6.

1. Cultivo celular y pasaje
   1. Prepare 50 mL de medio complementario para hESC agregando medio DMEM/F12 + 2 mM de L-Glutamina + 10% de suero fetal bovino (FBS) sin carbón vegetal + 1% de solución de penicilina/estreptomicina.
   2. Prepare 50 mL de medio complementario para Ishikawa agregando el Medio Eagle Modificado de Dulbecco + 10% FBS + 1% Penicilina/Estreptomicina Solución.
   3. Descongelación de células
      NOTA: La línea celular comprada se envió en hielo seco en estado congelado. Debe almacenarse en la fase de vapor de nitrógeno líquido o por debajo de -130 °C.
      1. Prepare todo el equipo esterilizado necesario y la enzima de disociación, y caliente el medio complementario a 37 °C.
      2. Descongele las células rápidamente en un baño de agua a 37 °C con un suave balanceo ocasional. Transfiera la suspensión celular a un tubo que contenga 5 mL de medio de cultivo basal y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
      3. Retire con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de medio de cultivo completo preparado y dispense en dos matraces de cultivo T25. Cultivar las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Preparación de las celdas con un cubreobjetos
   1. Utilice un cubreobjetos cuadrado de 18 mm como superficie del cultivo celular; Asegúrese de que el cubreobjetos esté limpio y estéril.
   2. Cubra el cubreobjetos en el fondo de una placa de 12 pocillos con 200 μL de matriz extracelular (MEC) a una concentración de 200-300 μg/mL. Mantenga la placa a 37 °C durante 1 h.
   3. Retire el ECM de la placa. Inspeccione las celdas para ver si tienen la confluencia adecuada y asegúrese de que la densidad de ambas líneas celulares sea de alrededor del 70%-80%
   4. Retire el medio gastado y lave las células con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 2 veces.
   5. Añadir 2 mL de enzima de disociación y cultivar las células a 37 °C durante 2 min para desprenderlas.
   6. Neutralizar con un medio de cultivo completo y crear una suspensión unicelular pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   7. Tomar 100 μL de la suspensión celular y mezclar con azul de tripano (factor de dilución = 2).
   8. Deslice el cubreobjetos sobre la cámara del hemocitómetro. Llene ambas cámaras laterales con la suspensión de celdas que contiene azul de tripán.
   9. Cuente el número de células en cuadrados a ambos lados bajo un microscopio de 20x y calcule la densidad de las células.
   10. Transfiera las células a la placa preparada con medio fresco e incube a 37 °C con 5% de CO₂. Siembre hESC en el pocillo a 1 x 10⁵ células/mL durante 24 h.
   11. Para la línea celular de Ishikawa, siembre la célula en el pocillo sin un cubreobjetos al día siguiente.

3. Montaje del modelo de cocultura

1. Remoje bien los andamios con alcohol etílico y agua destilada doble (ddw) durante 2 días. Esterilice los andamios con un autoclave a 121 °C y séquelos.
2. Agregue aproximadamente 2 mL de medio complementario para la línea celular Ishikawa al pozo de cultivo Ishikawa, asegurándose de que el nivel de líquido cubra el cubreobjetos.
3. Transfiera la cubierta de cubreobjetos con hESC al andamio y mantenga el lado con la celda hacia abajo. Conecta el andamio al pozo de cultivo Ishikawa. Para el segundo conjunto, invierta este arreglo transfiriendo la cubierta del cubreobjetos con Ishikawa al andamio y conectando el andamio al hESC de cultivo de pozos. Utilice las celdas sin la configuración del andamio para el análisis del crecimiento celular en crecimiento independiente.
4. Incubar el sistema de cocultivo a 37 °C, 5% de CO₂. El período de cocultivo puede variar dependiendo del diseño experimental, pero normalmente oscila entre 24 y 72 h.

4. Adquisición de imágenes

1. Retire con cuidado el medio de cultivo y enjuague las células suavemente con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
2. Retire los cubreobjetos con células adheridas de las placas de cultivo con pinzas finas o pinzas. Opcionalmente, coloque los cubreobjetos en un plato nuevo con PBS para evitar que se sequen durante la transferencia.
3. Tome un portaobjetos de microscopio limpio y coloque una gota de PBS. Transfiera suavemente el cubreobjetos que contiene las celdas a la gota de medio de montaje, asegurándose de que las celdas miren hacia abajo sobre el portaobjetos.
4. Coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio invertido. Seleccione la lente del objetivo adecuada (por ejemplo, 10x, 20x) y ajuste el enfoque usando perillas de enfoque grueso y fino.
5. Establezca los parámetros del microscopio, como la intensidad de la iluminación y la configuración de la cámara. Con el software del microscopio, capture imágenes de las células con los aumentos y campos de visión deseados. Ajuste el tiempo de exposición y otros ajustes de imagen para optimizar la calidad de la imagen.

5. Procesamiento de imágenes

1. Haga clic en Abrir para abrir la imagen, haga clic en Procesar > filtros > mejora en orden > Elegir ecualización local y haga clic en Aplicar.
2. Haga clic en Editar > Convertir a escala de grises > 8. Haga clic en Mejorar, elija Aplicar contraste.
3. Haga clic en Contar y medir asuntos. Haga clic en Manual, seleccione un rango y ajuste el histograma para asegurarse de que todas las celdas estén cubiertas.
4. Haga clic en Aplicar máscara, cierre la ventana actual, haga clic en Medición automática de objetos brillantes > medida, seleccione Medición y elija Era, Dendric, Densidad y Tamaño.
5. Haz clic en "Objetos brillantes automáticos" y, a continuación, haz clic en Recuento. Haga clic en Exportar datos para exportar los datos de medición a una hoja de cálculo.

6. Recolección de células

1. Retire los cubreobjetos del portaobjetos del microscopio y transfiéralos a un pozo limpio y seco.
2. Coseche la célula de Ishikawa con reactivo de aislamiento de ARN para transcriptómica o reactivo de lisis de Ripa para investigación proteómica.
   NOTA: En el caso de la hESC, el método de cultivo con cubreobjetos fue más eficaz para la captura de imágenes después de la tinción inmunitaria. Alternativamente, la hESC podría recolectarse con un reactivo de aislamiento de ARN o un reactivo de lisis de ripa. Las líneas celulares cultivadas en el cubreobjetos o en la superficie de la placa podrían intercambiarse; Sin embargo, recomendamos que las células preparadas para el análisis por imágenes se siembren en el cubreobjetos.

Resultados

La Figura 1 muestra el andamio casero para portaobjetos de células utilizado en este proceso, que consta de un anillo de soporte superior diseñado para la fijación a placas de cultivo celular estándar de 12 pocillos, complementado por un soporte de portaobjetos de células basales con cuatro estructuras en forma de varilla en forma de L.

De acuerdo con la Figura 2, la densidad de ambos tipos de c?...

Discusión

Se describe un protocolo simplificado y rentable para el cocultivo indirecto de células estromales y epiteliales endometriales. Este método utiliza un andamio casero para los portaobjetos de células, que consta de un anillo de soporte superior diseñado para la fijación a placas de cultivo celular estándar de 12 pocillos, complementado por un soporte de portaobjetos de células basales con cuatro estructuras en forma de varilla en forma de L. Esta configuración facilita la separaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme