使用两种贴壁细胞系的共培养模型

摘要

该方案展示了一种新颖 的体外 实验模型，该模型可以用三维 （3D） 打印支架概括两种贴壁细胞系的生物学特性。描述了该模型的构建和作程序，从细胞制备和细胞培养到分析和评估。

摘要

胚胎植入受母胚界面中不同细胞类型之间相互作用的影响。蜕膜内各种细胞类型之间的直接和间接通讯对于调节子宫内膜容受性至关重要;然而，介导这种相互作用的分子机制仍不清楚。在这方面，需要一个研究植入过程的模型来建立一个全面的 体外 模型，该模型可以概括子宫内膜上皮-基质相互作用的生物学。该模型由常规细胞培养板和匹配的支架组成，该支架由低成本材料 3D （3D） 打印而成。在这里，我们详细介绍了一组用于模型构建、细胞制备、细胞接种、细胞培养、观察和评估的方案。此外，我们还纳入了细胞在显微镜下表现出良好生长条件的代表性结果。本研究旨在开发模拟子宫内膜基质细胞和上皮细胞之间以及滋养层细胞和子宫内膜细胞之间相互作用的 体外 模型。

引言

尽管对人类妊娠进行了广泛的研究，但人们对着床和怀孕早期母胎界面的分子机制仍然知之甚少¹。人子宫内膜主要由两种细胞类型组成:子宫内膜上皮细胞 （EEC） 和子宫内膜基质细胞 （ESC）。植入经历三个阶段:并置、附着和侵袭，导致合格胚胎和接受性子宫内膜的发育²。考虑到人体 体内研究的 伦理限制，以及完全模拟动物体内状况的困难， 体外人体子宫 内膜培养模型的构建已成为复制植入和早期妊娠过程的有效手段³。这些模型在调查正常妊娠和病理妊娠方面都有价值，并为转化医学治疗干预的初步测试和验证提供了基础平台。

商业腔室已广泛用于细胞生物学研究。这些腔室为细胞迁移和不同类型细胞之间的串扰提供了有价值的见解。然而，商业腔室通常是一次性的，并且可能很昂贵⁴.

已经开发了大量由子宫内膜和囊胚或囊胚替代物组成的体外人类培养模型，以更好地了解植入的详细过程。然而，这些模型仍处于应用的初始阶段，因为 3D 结构是一个高度复杂的实验设置，并且某些特定的分化介质很昂贵 ^5,6,7。

使用经济实惠的 3D 打印硬件和相对较短的制造周期，可以针对不同的实验目的安装结构。3D 打印技术有助于降低时间成本，并支持创建复杂的定制结构。这项技术显着加速了原型设计和迭代，使其成为各个领域研究人员的宝贵工具，使他们能够更有效地完成工作 ^8,9,10。

在这里，我们提出了一种可行且经济的实验方案，用于构建 3D 结构及其用作细胞培养系统，它可以模拟子宫内膜基质和上皮细胞之间的相互作用，以研究胚胎植入过程中的子宫内膜容受性。这为商业一次性材料提供了一种可定制且低成本的替代方案。

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研究方案

注意:本实验步骤中使用的所有试剂都可以在 材料表中找到。除非另有说明，否则所有填料在使用前均已预平衡至 37 °C。

脚手架1. 3D打印和模型构建

注意:此处的步骤是根据商用 3D 金属打印机的手册执行的。这些步骤简要描述如下（补充文件 1）。

1. 打印床调平
   1. 点击 菜单 仪表板上的图标，然后导航到 实用工具.选择 Bed Level （床级别 ） 以启动调平例程。
   2. 从打印床中取出打印页，然后选择 Done（ 完成）。打印床将上升到其最大高度，为调平做准备。进度条达到 100% 后，按 Start 开始。
   3. 如果 Metal X 打印机之前未调平，请选择 Reset。如果已打开，请选择 Skip 并直接进入步骤 1.1.5（16 点扫描）。
   4. 使用 2.5 毫米六角扳手顺时针转动所有三床调平螺钉，直到它们拧紧。然后，逆时针旋转两整圈，将它们设置在中点高度，以松开它们。按 Done 继续。
   5. 打印机将在 16 个指定点扫描热床。在此过程中，请勿触摸床或框架。进度达到 100% 后，按 Next（下一步）。
2. 打印纸张应用
   1. 清除任何残留的金属或支撑碎屑。将 Vacuum （真空） 滑块切换为 On（开）。
   2. 让床降低并加热，然后按 Next（下一步）。将打印纸放在真空格栅上，然后按 Next（下一步）。
   3. 将印张机放在印张上，使其与打印室后部的 Z 导轨对齐。
   4. 等待真空接合并形成稳定的密封。真空吸尘器接合后，按 Done（完成）。
3. 金属丝负载
   1. 手动将打印头定位在打印区域的中央。向上滑动打印头盖并从安装螺钉上滑出，将其取下。
   2. 点击 菜单 选项板上的图标。从选项中选择 Materials 。
   3. 选择 Load Metal （加载金属 ） 以启动加载例程。选择 Quick Load （快速加载）。
   4. 选择要加载的特定金属材料类型（例如，铝 6061-T6 | 3.3211 | 65028 |AlMg1SiCu）。
   5. 将线轴放在支架上，然后按 Next（下一步）。关上门，让线轴预热，然后按 Next（下一步）。
   6. 将材料插入打印头的前入口（标记为 M），直到挤出机开始将其吸入。
4. 金属零件打印
   1. 在 Printing Settings 面板中，单击 Export Build。将文件保存到格式化为 FAT32 的 USB 驱动器，然后将其插入打印机。
   2. 选择板上的 Menu 图标。导航到 存储 并选择 从存储打印。选择要开始打印的零件文件。
5. 金属部件的拆卸
   1. 小心地将打印页和打印部件从打印床上滑下。轻轻地从打印页上拆下部件。柔性片材应该很容易剥落。

2. 在 3D 模型中准备细胞共培养

注意:建议使用耐高温材料作为 3D 打印细胞盖玻片支架支架的耗材，以便于在每次用于细胞培养实验之前进行高压灭菌。本研究使用了永生化人子宫内膜基质细胞 （HESC） 和人子宫内膜上皮细胞 （Ishikawa）。这些细胞系的表征之前已经报道过 ^5,6。

1. 细胞培养和传代
   1. 通过添加 DMEM/F12 培养基 + 2 mM L-谷氨酰胺 + 10% 木炭剥离胎牛血清 （FBS） + 1% 青霉素/链霉素溶液，制备 50 mL 用于 hESC 的补充培养基。
   2. 通过添加 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素溶液，为 Ishikawa 制备 50 mL 补充培养基。
   3. 细胞解冻
      注:购买的细胞系在冷冻状态的干冰上运输。应贮存于液氮气相或-130°C以下。
      1. 准备所有必要的灭菌设备和解离酶，并将补充培养基加热至 37 °C。
      2. 在 37 °C 水浴中快速解冻细胞，偶尔轻轻摇晃。将细胞悬液转移到含有 5 mL 基础培养基的试管中，并以 200 x g 离心 5 分钟。
      3. 小心去除上清液。将细胞沉淀重悬于 5 mL 准备好的完全培养基中，并将其分配到两个 T25 培养瓶中。在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中培养细胞。
2. 用盖玻片制备细胞
   1. 使用 18 mm 方形盖玻片作为细胞培养物的表面;确保盖玻片清洁无菌。
   2. 在 12 孔板底部涂上 200 μL 浓度为 200-300 μg/mL 的细胞外基质 （ECM） 的盖玻片。将板在 37 °C 下保持 1 小时。
   3. 从板中取出 ECM。检查细胞是否适当汇合，并确保两种细胞系的密度在 70%-80% 左右
   4. 取出用过的培养基，用 3 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞 2 次。
   5. 加入 2 mL 解离酶，并在 37 °C 下培养细胞 2 分钟以分离它们。
   6. 用完全培养基中和，并通过上下吹打制备单细胞悬液。
   7. 取 100 μL 细胞悬液，与台盼蓝（稀释因子 =2）混合。
   8. 将盖玻片滑过血细胞计数器的腔室。用含有台盼蓝的细胞悬液填充两侧腔室。
   9. 在 20 倍显微镜下计算两侧正方形的细胞数并计算细胞密度。
   10. 将细胞转移到装有新鲜培养基的制备板中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。以 1 x 10⁵ 个细胞/mL 的浓度将 hESC 接种到孔中，持续 24 小时。
   11. 对于 Ishikawa 细胞系，第二天将细胞接种到没有盖玻片的孔中。

3. 共培养模型的组装

1. 用乙醇和双蒸水 （ddw） 彻底浸泡支架 2 天。用 121 °C 的高压灭菌器对支架进行消毒并干燥。
2. 将约 2 mL 用于 Ishikawa 细胞系的补充培养基添加到培养 Ishikawa 的孔中，确保液面覆盖盖玻片。
3. 将带有 hESC 的盖玻片盖转移到脚手架上，并保持细胞朝下的一侧。将脚手架插入培养良好的 Ishikawa。对于第二组，通过将带有 Ishikawa 的盖玻片盖转移到支架上并将支架插入培养良好的 hESC 中来颠倒这种安排。使用没有支架设置的细胞进行独立生长的细胞生长分析。
4. 将共培养系统在 37 °C、5% CO₂ 下孵育。共培养期可能因实验设计而异，但通常为 24-72 小时。

4. 图像采集

1. 小心取出培养基，并用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗细胞。
2. 使用细镊子或镊子从培养皿中取出带有附着细胞的盖玻片。或者，将盖玻片放入装有 PBS 的新培养皿中，以防止在转移过程中干燥。
3. 取干净的显微镜载玻片并滴入一滴 PBS。轻轻地将含有细胞的盖玻片转移到封固剂液滴上，确保细胞面朝下放在载玻片上。
4. 将准备好的载玻片放在倒置显微镜的载物台上。选择合适的物镜（例如 10 倍、20 倍）并使用粗调和细调焦旋钮调整焦距。
5. 设置显微镜参数，例如照明强度和相机设置。使用显微镜软件，以所需的放大倍率和视野捕获细胞图像。调整曝光时间和其他成像设置以优化图像质量。

5. 图像处理

1. 单击 打开 以打开图像，单击 处理>过滤器 > 增强 以> 选择局部均衡，然后单击 应用。
2. 点击 编辑 > 转换为 > 灰度 8.单击 Enhance，选择 Apply Contrast。
3. 单击 Count and measure subjects（计数和测量主题）。点击 手动，选择一个范围，然后调整直方图以确保覆盖所有单元格。
4. 单击 应用蒙版，关闭当前窗口，单击 自动亮对象>测量， 选择 测量，然后选择 Aera、Dendric、Density 和 Size。
5. 点按 "自动明亮对象"，然后点按 "计数"。单击 Export Data 将测量数据导出到电子表格。

6. 细胞收获

1. 从显微镜载玻片上取下盖玻片，并将其转移到干净干燥的孔中。
2. 使用 RNA 分离试剂收获 Ishikawa 细胞，用于转录组学，或使用 Ripa 裂解试剂进行蛋白质组学研究。
   注意:对于 hESC，盖玻片培养方法对免疫染色后的图像捕获更有效。或者，可以使用 RNA 分离试剂或 Ripa 裂解试剂收获 hESC。可以交换在盖玻片或板表面培养的细胞系;但是，我们建议将制备用于成像分析的细胞接种在盖玻片上。

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结果

图 1 显示了该工艺中使用的用于细胞载玻片的自制支架，其中包括一个为连接到标准 12 孔细胞培养板而定制的上支撑环，并辅以具有四个 L 形棒状结构的基础细胞载玻片支架。

根据图 2，共培养条件（图 2A、B）中两种细胞类型的密度在共培养 72 小时后仍然很低;然而，?...

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讨论

描述了一种简化且具有成本效益的方案，用于子宫内膜基质细胞和上皮细胞的间接共培养。该方法利用自制的细胞载玻片支架，该支架包括一个为连接到标准 12 孔细胞培养板而定制的上支撑环，并辅以具有四个 L 形棒状结构的基础细胞载玻片支架。这种设置有助于子宫内膜基质细胞和上皮细胞的分离，同时允许它们通过培养基中信号分子的交换进行相互作用。这种方法?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme