Modelo de co-cultura usando dois tipos de linhagens celulares aderentes

Resumo

O protocolo mostra um novo modelo experimental in vitro que pode recapitular a biologia de dois tipos de linhagens celulares aderentes com um andaime impresso em tridimensional (3D). A construção deste modelo e os procedimentos operacionais, desde a preparação e cultura celular até a análise e avaliação, são descritos.

Resumo

A implantação embrionária é afetada pelas interações entre diferentes tipos de células na interface mãe-embrião. As comunicações diretas e indiretas entre vários tipos de células dentro da decídua são cruciais para regular a receptividade endometrial; no entanto, os mecanismos moleculares que medeiam essa interação ainda não estão claros. Nesse sentido, é necessário um modelo para estudar o processo de implantação para estabelecer um modelo in vitro abrangente que possa recapitular a biologia da interação epitélio-estroma endometrial. Este modelo é composto por placas regulares de cultura de células e um andaime correspondente, que é gerado por impressão tridimensional (3D) a partir de materiais de baixo custo. Aqui, detalhamos um conjunto de protocolos para construção de modelos, preparação de células, semeadura de células, cultura de células, observação e avaliação. Além disso, incluímos resultados representativos com células exibindo boas condições de crescimento ao microscópio. Este estudo teve como objetivo desenvolver modelos in vitro que mimetizassem a interação entre células estromais endometriais e células epiteliais, bem como entre células trofoblásticas e células endometriais.

Introdução

Apesar da extensa pesquisa sobre a gravidez humana, os mecanismos moleculares na interface materno-fetal durante a implantação e o início da gravidez permanecem pouco compreendidos¹. O endométrio humano é composto principalmente por dois tipos de células: células epiteliais endometriais (EECs) e células estromais endometriais (ESCs). A implantação progride através de três estágios: aposição, fixação e invasão, que levam ao desenvolvimento de um embrião competente e endométrio receptivo². Considerando as restrições éticas dos estudos in vivo em seres humanos, bem como as dificuldades em simular completamente a condição humana em animais, a construção de modelos de cultura de endométrio humano in vitro tornou-se um meio eficaz de replicar os processos de implantação e gravidez precoce³. Esses modelos são valiosos na investigação de gestações normais e patológicas e fornecem uma plataforma fundamental para o teste preliminar e validação de intervenções terapêuticas em medicina translacional.

As câmaras comerciais têm sido amplamente utilizadas na pesquisa biológica celular. Essas câmaras oferecem informações valiosas sobre a migração celular e a interferência entre diferentes tipos de células. No entanto, as câmaras comerciais são tipicamente de uso único e podem ser caras⁴.

Um grande número de modelos de cultura humana in vitro consistindo de endométrio e blastocisto, ou substitutos de blastocisto, foram desenvolvidos para entender melhor o processo detalhado de implantação. Esses modelos, no entanto, ainda estão em seu estágio inicial de aplicação, uma vez que a estrutura 3D é uma configuração experimental altamente complicada e certos meios de diferenciação específicos são caros ^5,6,7.

O uso de hardware de impressão 3D acessível e um período de fabricação relativamente curto possibilitam o ajuste de estruturas para diferentes fins experimentais. As técnicas de impressão 3D ajudam a reduzir os custos de tempo e permitem a criação de estruturas complexas e personalizadas. Essa tecnologia acelera significativamente o design e a iteração do protótipo, tornando-se uma ferramenta valiosa para pesquisadores de vários campos, permitindo que eles concluam seu trabalho com mais eficiência ^8,9,10.

Aqui, apresentamos um protocolo experimental viável e econômico para a construção da estrutura 3D e seu uso como sistema de cultura celular, que pode simular a interação entre células estromais endometriais e epiteliais para investigação da receptividade endometrial durante a implantação embrionária. Isso fornece uma alternativa personalizável e de baixo custo para material descartável comercial.

Protocolo

NOTA: Todos os reagentes usados neste protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Salvo indicação em contrário, todos os meios foram pré-equilibrados a 37 °C antes da utilização.

1. 3D impressão do andaime e construção do modelo

NOTA: As etapas aqui foram executadas de acordo com o manual da máquina de impressão 3D de metal comercial. As etapas são descritas brevemente abaixo (Arquivo Suplementar 1).

1. Nivelamento da mesa de impressão
   1. Toque no ícone Menu no painel e navegue até Utilitários. Selecione Nível da cama para iniciar a rotina de nivelamento.
   2. Remova a folha de impressão da mesa de impressão e selecione Concluído. A mesa de impressão subirá até sua altura máxima em preparação para o nivelamento. Quando a barra de progresso atingir 100%, pressione Iniciar.
   3. Se a impressora Metal X não tiver sido nivelada anteriormente, selecione Redefinir. Em caso afirmativo, escolha Ignorar e prossiga diretamente para a Etapa 1.1.5 (a verificação de 16 pontos).
   4. Use uma chave sextavada de 2.5 mm para girar todos os parafusos de nivelamento de três camas no sentido horário até que estejam apertados. Em seguida, afrouxe-os girando duas rotações completas no sentido anti-horário para colocá-los em uma altura média. Pressione Concluído para continuar.
   5. A impressora digitalizará a cama em 16 pontos designados. Evite tocar na cama ou na estrutura durante este processo. Quando o progresso atingir 100%, pressione Avançar.
2. Aplicativo de folha de impressão
   1. Remova qualquer metal residual ou detritos de suporte. Alterne o controle deslizante Vácuo para Ativado.
   2. Deixe a cama abaixar e aquecer e pressione Avançar. Coloque a folha de impressão sobre a grade de vácuo e pressione Avançar.
   3. Posicione a impressora de folhas sobre a folha de impressão, alinhando-a com os trilhos Z na parte traseira da câmara.
   4. Aguarde até que o vácuo engate e crie uma vedação estável. Assim que o aspirador estiver ativado, pressione Concluído.
3. Carregamento de filamentos metálicos
   1. Posicione manualmente a cabeça de impressão no centro da área de impressão. Remova a tampa da cabeça de impressão deslizando-a para cima e para fora dos parafusos de montagem.
   2. Toque no ícone Menu no painel de opções. Selecione Materiais nas opções.
   3. Escolha Carregar metal para iniciar a rotina de carregamento. Escolha Carregamento rápido.
   4. Seleccione o tipo específico de material metálico a carregar (por exemplo, alumínio 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Coloque o carretel no suporte e pressione Avançar. Feche a porta e deixe os carretéis aquecerem e pressione Avançar.
   6. Insira o material na entrada frontal da cabeça de impressão (rotulada como M) até que a extrusora comece a puxá-lo.
4. Impressão de peças metálicas
   1. No painel Configurações de impressão, clique em Exportar compartimentod. Salve o arquivo em uma unidade USB formatada para FAT32 e insira-o na impressora.
   2. Selecione o ícone Menu no quadro. Navegue até Armazenamento e selecione Imprimir do armazenamento. Escolha o arquivo de peça para iniciar a impressão.
5. Remoção de peças metálicas
   1. Deslize cuidadosamente a folha de impressão e as peças impressas para fora da mesa de impressão. Retire cuidadosamente as peças da folha de impressão. A folha flexível deve descascar com facilidade.

2. Preparação para co-cultura celular no modelo 3D

NOTA: Recomenda-se que materiais resistentes a altas temperaturas sejam usados como consumíveis para suportes de andaime de lamínula de célula de impressão 3D para facilitar a esterilização em autoclave antes de cada uso em experimentos de cultura de células. Células estromais endometriais humanas imortalizadas (HESC) e células epiteliais endometriais humanas (Ishikawa) foram usadas neste estudo. A caracterização dessas linhagens celulares já foi relatada anteriormente ^5,6.

1. Cultura de células e passagem
   1. Prepare 50 mL de meio complementar para hESC adicionando meio DMEM / F12 + 2 mM de L-glutamina + 10% de soro fetal bovino (FBS) sem carvão + 1% de solução de penicilina / estreptomicina.
   2. Prepare 50 mL de meio complementar para Ishikawa adicionando o meio de águia modificado de Dulbecco + 10% de FBS + 1% de solução de penicilina/estreptomicina.
   3. Descongelamento celular
      NOTA: A linha celular adquirida foi enviada em gelo seco congelado. Deve ser armazenado na fase de vapor de nitrogênio líquido ou abaixo de -130 °C.
      1. Preparar todo o equipamento esterilizado e a enzima de dissociação necessários e aquecer o meio complementar a 37 °C.
      2. Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37 °C com oscilações suaves ocasionais. Transferir a suspensão celular para um tubo contendo 5 ml de meio de cultura basal e centrifugar a 200 x g durante 5 min.
      3. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de meio de cultura completo preparado e distribuí-lo em dois balões de cultura T25. Cultivar as células numa estufa a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Preparação de células com lamínula
   1. Utilizar uma lamínula quadrada de 18 mm como superfície da cultura de células; Certifique-se de que a lamínula esteja limpa e estéril.
   2. Cubra a lamínula no fundo de uma placa de 12 poços com 200 μL de matriz extracelular (ECM) a uma concentração de 200-300 μg / mL. Manter a placa a 37 °C durante 1 h.
   3. Remova o ECM da placa. Inspecione as células quanto à confluência apropriada e certifique-se de que a densidade de ambas as linhagens celulares esteja em torno de 70% a 80%
   4. Remova o meio gasto e lave as células com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 2x.
   5. Adicione 2 mL de enzima de dissociação e cultive as células a 37 °C por 2 min para separá-las.
   6. Neutralize com meio de cultura completo e crie uma suspensão unicelular pipetando para cima e para baixo.
   7. Tomar 100 μL da suspensão celular e misturar com azul de tripano (fator de diluição = 2).
   8. Deslize a lamínula sobre a câmara do hemocitômetro. Encher ambas as câmaras laterais com a suspensão celular contendo azul de tripano.
   9. Conte o número de células em quadrados de ambos os lados sob um microscópio de 20x e calcule a densidade das células.
   10. Transferir as células para a placa preparada com meio fresco e incubar a 37 °C com 5% de CO₂. Semeie hESC no poço a 1 x 10⁵ células/mL por 24 h.
   11. Para a linha celular de Ishikawa, semeie a célula no poço sem uma lamínula no dia seguinte.

3. Montagem do modelo de cocultura

1. Mergulhe bem os andaimes com álcool etílico e água bidestilada (ddw) por 2 dias. Esterilize os andaimes com uma autoclave a 121 °C e seque-os.
2. Adicione cerca de 2 mL de meio complementar para a linha celular de Ishikawa à cultura de poços de Ishikawa, garantindo que o nível do líquido cubra a lamínula.
3. Transfira a tampa da lamínula com hESC para o andaime e mantenha o lado com a célula abaixada. Conecte o andaime no Ishikawa de bem cultivo. Para o segundo conjunto, inverta esse arranjo transferindo a cobertura da lamínula com Ishikawa para o andaime e conectando o andaime no hESC de cultura adequada. Use as células sem a configuração do andaime para análise de crescimento celular independente.
4. Incubar o sistema de co-cultura a 37 °C, 5% CO₂. O período de co-cultura pode variar dependendo do desenho experimental, mas normalmente varia de 24 a 72 h.

4. Aquisição de imagem

1. Remova cuidadosamente o meio de cultura e enxágue as células suavemente com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
2. Remova lamínulas com células anexadas de placas de cultura usando pinças ou pinças finas. Opcionalmente, coloque as lamínulas em um novo prato com PBS para evitar o ressecamento durante a transferência.
3. Pegue uma lâmina de microscópio limpa e coloque uma gota de PBS. Transfira suavemente as células contendo lamínula para a gota do meio de montagem, garantindo que as células fiquem voltadas para baixo na lâmina.
4. Coloque a lâmina preparada no palco do microscópio invertido. Selecione a lente objetiva apropriada (por exemplo, 10x, 20x) e ajuste o foco usando botões de foco grosso e fino.
5. Defina os parâmetros do microscópio, como intensidade de iluminação e configurações da câmera. Usando o software do microscópio, capture imagens das células nas ampliações e campos de visão desejados. Ajuste o tempo de exposição e outras configurações de imagem para otimizar a qualidade da imagem.

5. Processamento de imagem

1. Clique em Abrir para abrir a imagem, clique em Processar > Filtros > Aprimoramento para > Escolher Equalização Local e clique em Aplicar.
2. Clique em Editar > Converter para > Escala de Cinza 8. Clique em Aprimorar, escolha Aplicar Contraste.
3. Clique em Contar e medir assuntos. Clique em Manual, selecione um intervalo e ajuste o histograma para garantir que todas as células estejam cobertas.
4. Clique em Aplicar máscara, feche a janela atual, clique em Objetos brilhantes automáticos > Medir, selecione Medição e escolha Aera, Dendric, Density e Size.
5. Clique em "Objetos brilhantes automáticos" e, em seguida, clique em Contagem. Clique em Exportar dados para exportar os dados de medição para uma planilha.

6. Colheita de células

1. Remova as lamínulas da lâmina do microscópio e transfira-as para um poço limpo e seco.
2. Colha a célula de Ishikawa com reagente de isolamento de RNA para transcriptômica ou reagente de lise de Ripa para pesquisa proteômica.
   NOTA: Para hESC, o método de cultura de lamínula foi mais eficaz para captura de imagem após coloração imunológica. Alternativamente, o hESC pode ser colhido com reagente de isolamento de RNA ou reagente de lise de Ripa. As linhas celulares cultivadas na lamínula ou na superfície da placa podem ser trocadas; no entanto, recomendamos que as células preparadas para análise de imagem sejam semeadas na lamínula.

Resultados

A Figura 1 mostra o andaime caseiro para lâminas de células usado neste processo, que compreende um anel de suporte superior adaptado para fixação em placas de cultura de células padrão de 12 poços, complementado por um suporte de lâmina de célula basal com quatro estruturas em forma de L em forma de haste.

De acordo com a Figura 2, a densidade de ambos os tipos celulares na condição de co-...

Discussão

Um protocolo simplificado e custo-efetivo é descrito para a co-cultura indireta de células estromais e epiteliais endometriais. Este método utiliza um andaime caseiro para lâminas de células, que compreende um anel de suporte superior adaptado para fixação em placas de cultura de células padrão de 12 poços, complementado por um suporte de lâmina de célula basal com quatro estruturas semelhantes a hastes em forma de L. Essa configuração facilita a separação das células es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme