두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

요약

이 프로토콜은 3차원(3D) 프린팅 골격으로 두 종류의 부착 세포주의 생물학을 재현할 수 있는 새로운 체외 실험 모델을 보여줍니다. 이 모델의 구성과 세포 준비 및 세포 배양에서 분석 및 평가에 이르는 운영 절차에 대해 설명합니다.

초록

배아 착상은 모체-배아 계면에서 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용에 의해 영향을 받습니다. decidua 내의 다양한 세포 유형 간의 직간접적인 의사소통은 자궁내막 수용성을 조절하는 데 중요합니다. 그러나 이러한 상호 작용을 매개하는 분자 메커니즘은 아직 불분명합니다. 이와 관련하여, 자궁내막 상피-기질 상호작용의 생물학을 요약할 수 있는 포괄적인 체외 모델을 확립하기 위해서는 이식 과정을 연구하기 위한 모델이 필요합니다. 이 모델은 일반 세포 배양 플레이트와 일치하는 스캐폴드로 구성되며, 이는 저비용 재료로 3차원(3D) 프린팅으로 생성됩니다. 여기에서는 모델 구성, 세포 준비, 세포 파종, 세포 배양, 관찰 및 평가를 위한 일련의 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 현미경 아래에서 양호한 성장 조건을 보이는 세포에 대한 대표적인 결과를 포함시켰습니다. 이 연구는 자궁내막 기질 세포와 상피 세포 사이, 영양막 세포와 자궁 내막 세포 사이의 상호 작용을 모방하는 체외 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다.

서문

인간 임신에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 착상과 임신 초기에 모체-태아 계면의 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있다¹. 인간의 자궁내막은 주로 자궁내막 상피세포(EEC)와 자궁내막기질세포(ESC)의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 착상은 고정(apposition), 부착(attachment), 침입(invasion)의 세 단계를 거쳐 유능한 배아(competent embryo)와 수용성 자궁내막(receptive endometrium)²의 발달로 이어집니다. 인간 피험자에 대한 생체 내 연구의 윤리적 제약과 동물의 인간 상태를 완전히 시뮬레이션하는 것의 어려움을 고려할 때, 체외 인간 자궁 내막 배양 모델의 구축은 이식 및 초기 임신 과정을 복제하는 효과적인 수단이 되었습니다³. 이러한 모델은 정상 임신과 병리학적 임신 모두를 조사하는 데 가치가 있으며 중개 의학에서 치료 개입의 예비 테스트 및 검증을 위한 기초 플랫폼을 제공합니다.

상업용 챔버는 세포 생물학 연구에 널리 활용되어 왔습니다. 이 챔버는 세포 이동과 서로 다른 유형의 세포 간의 누화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그러나 상업용 챔버는 일반적으로 일회용이며 비용이 많이 들 수 있습니다⁴.

자궁내막과 배반포 또는 배반포 대리모로 구성된 수많은 체외 인간 배양 모델이 개발되어 이식의 자세한 과정을 더 잘 이해할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델은 3D 구조가 매우 복잡한 실험 설정이고 특정 특정 차별화 매체가 비싸기 때문에 여전히 초기 응용 단계에 있습니다 ^5,6,7.

저렴한 3D 프린팅 하드웨어를 사용하고 제조 기간이 비교적 짧기 때문에 다양한 실험 목적을 목표로 구조를 조정할 수 있습니다. 3D 프린팅 기술은 시간 비용을 줄이고 복잡한 맞춤형 구조를 만들 수 있도록 합니다. 이 기술은 프로토타입 설계 및 반복을 크게 가속화하여 다양한 분야의 연구자에게 유용한 도구가 되어 작업을 보다 효율적으로 완료할 수 있도록 합니다 ^8,9,10.

여기에서는 배아 착상 중 자궁내막 수용성을 조사하기 위해 자궁내막 기질 세포와 상피 세포 간의 상호 작용을 시뮬레이션할 수 있는 3D 구조의 구성 및 세포 배양 시스템으로의 사용을 위한 실현 가능하고 경제적인 실험 프로토콜을 제시합니다. 이것은 상업용 일회용 재료에 대한 맞춤형 및 저렴한 대안을 제공합니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 시약은 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 매체는 사용 전에 37°C로 사전 평형화되었습니다.

비계 및 모형 건설의 1. 3D 인쇄

참고: 여기에 있는 단계는 상업용 3D 금속 인쇄기의 매뉴얼 북에 따라 수행되었습니다. 단계는 아래에 간략하게 설명되어 있습니다(보충 파일 1).

1. 프린트 베드 레벨링
   1. 대시보드에서 Menu(메뉴 ) 아이콘을 누르고 Utilities(유틸리티)로 이동합니다. 침대 수준을 선택하여 레벨링 루틴을 시작합니다.
   2. 프린트 베드에서 인쇄 용지를 제거하고 완료(Done)를 선택합니다. 프린트 베드는 레벨링을 준비하기 위해 최대 높이까지 올라갑니다. 진행률 표시줄이 100%에 도달하면 시작을 누릅니다.
   3. Metal X 프린터가 이전에 수평을 맞추지 않은 경우 재설정을 선택합니다. 필요한 경우 Skip(건너뛰기 )을 선택하고 1.1.5단계(16포인트 스캔)로 바로 진행합니다.
   4. 2.5mm 육각 키를 사용하여 모든 3베드 수평 조절 나사가 단단히 조여질 때까지 시계 방향으로 돌립니다. 그런 다음 시계 반대 방향으로 완전히 두 바퀴 돌려 중간 높이 위치에 놓아 풉니다. 계속하려면 완료 를 누릅니다.
   5. 프린터는 16개의 지정된 지점에서 침대를 스캔합니다. 이 과정에서 침대나 프레임을 만지지 마십시오. 진행률이 100%에 도달하면 다음을 누릅니다.
2. 인쇄 시트 응용 프로그램
   1. 잔여 금속 또는 지지 파편을 제거합니다. 진공 슬라이더를 켜기로 전환합니다.
   2. 침대를 낮추고 가열한 후 다음을 누릅니다. 인쇄 용지를 진공 격자 위에 놓고 다음(Next)을 누릅니다.
   3. 시트 프레스를 인쇄 시트 위에 놓고 챔버 후면의 Z-레일에 맞춥니다.
   4. 진공이 맞물려 안정적인 밀봉이 생성될 때까지 기다립니다. 진공 청소기가 작동되면 완료를 누릅니다.
3. 금속 필라멘트 적재
   1. 프린트 헤드를 인쇄 영역의 중앙에 수동으로 배치합니다. 프린트 헤드 커버를 위로 밀어 장착 나사를 분리하여 제거합니다.
   2. 옵션 보드에서 메뉴 아이콘을 누릅니다. 옵션에서 재질 을 선택합니다.
   3. Load Metal을 선택하여 로딩 루틴을 시작합니다. Quick Load(빠른 로드)를 선택합니다.
   4. 로드할 특정 유형의 금속 재료(예: 알루미늄 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu)입니다.
   5. 스풀을 홀더에 놓고 다음을 누릅니다. 도어를 닫고 스풀이 예열될 때까지 기다린 후 다음을 누릅니다.
   6. 압출기가 재료를 빨아들이기 시작할 때까지 프린트 헤드의 전면 입구(M으로 표시됨)에 재료를 삽입합니다.
4. 금속 부품 인쇄
   1. Printing Settings(인쇄 설정) 패널에서 Export Buil d(내보내기 프로젝트)를 클릭합니다. FAT32로 포맷된 USB 드라이브에 파일을 저장하고 프린터에 삽입합니다.
   2. 보드에서 메뉴 아이콘을 선택합니다. Storage(스토리지)로 이동하여 Print From Storage(스토리지에서 인쇄)를 선택합니다. 인쇄를 시작할 부품 파일을 선택합니다.
5. 금속 부분 제거
   1. 프린트 시트와 프린트된 부품을 프린트 베드에서 조심스럽게 밀어냅니다. 인쇄 시트에서 부품을 조심스럽게 분리합니다. 유연한 시트는 쉽게 벗겨져야 합니다.

2. 3D 모델에서 세포 공동 배양을 위한 준비

참고: 세포 배양 실험에 사용하기 전에 오토클레이브 멸균을 용이하게 하기 위해 고온 내성 재료를 3D 프린팅 셀 커버슬립 스캐폴드 지지대의 소모품으로 사용하는 것이 좋습니다. 이 연구에서는 불멸화된 인간 자궁내막 기질 세포(HESC)와 인간 자궁내막 상피 세포(이시카와)를 사용했습니다. 이러한 세포주의 특성화는 이전에 보고된 바 있습니다 ^5,6.

1. 세포 배양 및 계대 배양
   1. DMEM/F12 배지 + 2mM L-글루타민 + 10% 숯이 제거된 소 태아 혈청(FBS) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가하여 hESC에 대한 보형 배지 50mL를 준비합니다.
   2. Dulbecco의 Modified Eagle 배지 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가하여 이시카와를 위한 보완 배지 50mL를 준비합니다.
   3. 세포 해동
      참고: 구매한 세포주는 냉동 상태로 드라이아이스에 담겨 배송되었습니다. 액체 질소의 증기상 또는 -130 °C 이하에서 보관해야 합니다.
      1. 필요한 모든 멸균 장비와 해리 효소를 준비하고 보색 배지를 37°C로 예열합니다.
      2. 37°C 수조에서 가끔 부드럽게 흔들면서 세포를 빠르게 해동합니다. 세포 현탁액을 5mL의 기저 배양 배지와 200 x g 에서 5분 동안 원심분리가 들어 있는 튜브로 옮깁니다.
      3. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 준비된 완전 배양 배지 5mL에 세포 펠렛을 재현탁하고 두 개의 T25 배양 플라스크에 분배합니다. 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO₂에서 세포를 배양합니다.
2. 커버슬립(coverslip)을 이용한 세포 준비
   1. 18mm 정사각형 커버슬립을 세포 배양의 표면으로 사용합니다. 커버슬립이 깨끗하고 멸균되었는지 확인하십시오.
   2. 12웰 플레이트 바닥의 커버슬립을 200-300μg/mL 농도의 200μL의 세포외 기질(ECM)로 코팅합니다. 플레이트를 37 ° C에서 1 시간 동안 유지하십시오.
   3. 플레이트에서 ECM을 제거합니다. 세포의 적절한 밀도를 검사하고 두 세포주의 밀도가 약 70%-80%인지 확인합니다.
   4. 사용한 배지를 제거하고 3mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 2x로 세포를 세척합니다.
   5. 해리 효소 2mL를 첨가하고 세포를 37°C에서 2분 동안 배양하여 분리합니다.
   6. 완전한 배양 배지로 중화하고 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
   7. 세포 현탁액 100μL를 취하여 트리판 블루(희석 계수 = 2)와 혼합합니다.
   8. 커버슬립을 혈구계의 챔버 위로 밉니다. 양쪽 챔버를 trypan blue가 포함된 세포 현탁액으로 채웁니다.
   9. 20x 현미경으로 양쪽의 사각형으로 세포 수를 세고 세포의 밀도를 계산합니다.
   10. 새로운 배지로 준비된 플레이트로 세포를 옮기고 37 ° C에서 5 % CO₂로 배양합니다. 24시간 동안 1 x 10⁵ cells/mL의 웰에 hESC를 시딩합니다.
   11. Ishikawa 세포주의 경우, 다음날 커버슬립 없이 세포를 웰에 파종합니다.

3. 공동 문화 모델의 조립

1. 골격을 에틸 알코올과 이중 증류수(ddw)에 2일 동안 완전히 담그십시오. 121°C에서 오토클레이브로 골격을 살균하고 건조시킵니다.
2. 이시카와 세포주를 위한 약 2mL의 보형 배지를 이시카와 우물 배양에 추가하여 액체 레벨이 커버슬립을 덮도록 합니다.
3. hESC가 있는 커버슬립 덮개를 비계로 옮기고 셀이 아래로 향하게 합니다. 잘 배양된 이시카와에 비계를 꽂습니다. 두 번째 세트의 경우 Ishikawa가 있는 커버슬립 덮개를 골격에 옮기고 골격을 잘 배양된 hESC에 연결하여 이 배열을 반전시킵니다. 독립적으로 성장하는 세포 성장 분석을 위해 스캐폴드 설정이 없는 세포를 사용합니다.
4. 공동 배양 시스템을 37 ° C, 5 % CO₂에서 배양합니다. 공동 배양 기간은 실험 설계에 따라 달라질 수 있지만 일반적으로 24-72시간 사이입니다.

4. 이미지 획득

1. 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다.
2. 배양 접시에서 세포가 부착된 커버슬립을 가는 집게 또는 핀셋을 사용하여 제거합니다. 선택적으로 PBS가 있는 새 접시에 커버슬립을 넣어 이송 중 건조를 방지합니다.
3. 깨끗한 현미경 슬라이드를 가지고 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 세포가 들어 있는 커버슬립을 장착 매체의 드롭으로 부드럽게 옮기고 세포가 슬라이드를 향하도록 합니다.
4. 준비된 슬라이드를 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경의. 적절한 대물 렌즈(예: 10x, 20x)를 선택하고 거친과 미세한 초점 노브를 사용하여 초점을 조정합니다.
5. 조명 강도 및 카메라 설정과 같은 현미경 매개변수를 설정합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 원하는 배율과 시야에서 세포의 이미지를 캡처합니다. 노출 시간 및 기타 이미징 설정을 조정하여 이미지 품질을 최적화합니다.

5. 이미지 처리

1. Open(열기)을 클릭하여 이미지를 열고 Process > Filters > Enhancement(필터 향상)를 클릭하여 Local Equalization(로컬 이퀄라이제이션)> 선택한 다음 Apply(적용)를 클릭합니다.
2. 편집을 클릭하여 > 그레이 스케일 8> 변환합니다. Enhance(향상)를 클릭하고 Apply Contrast(대비 적용)를 선택합니다.
3. Count and measure subjects(주제 계산 및 측정)를 클릭합니다. Manual(수동)을 클릭하고 범위를 선택한 다음 히스토그램을 조정하여 모든 셀이 포함되도록 합니다.
4. Apply Mask(마스크 적용)를 클릭하고, 현재 창을 닫고, Automatic Bright Objects > Measure(측정 기준), Select Measurement(측정)를 차례로 클릭한 다음 Aera, Dendric, Density 및 Size(크기)를 선택합니다.
5. Automatic Bright Objects(자동 밝기 개체)를 클릭한 다음 Count(개수)를 클릭합니다. Export Data(데이터 내보내기)를 클릭하여 측정 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.

6. 세포 수확

1. 현미경 슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 깨끗하고 건조한 우물에 옮깁니다.
2. 전사체학을 위한 RNA 분리 시약 또는 단백질체 연구를 위한 Ripa 용해 시약으로 Ishikawa 세포를 수확합니다.
   참고: hESC의 경우 커버슬립 배양 방법이 면역 염색 후 이미지 캡처에 더 효과적이었습니다. 또는 RNA 분리 시약 또는 Ripa 용해 시약으로 hESC를 수확할 수 있습니다. 커버슬립 또는 플레이트의 표면에서 배양된 세포주는 교환될 수 있고; 그러나 이미징 분석을 위해 준비된 세포는 커버슬립에 파스딩하는 것이 좋습니다.

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결과

그림 1은 이 공정에 사용되는 세포 슬라이드용 수제 스캐폴드를 보여주며, 이는 표준 12웰 세포 배양 플레이트에 부착할 수 있도록 맞춤화된 상부 지지 링으로 구성되며 4개의 L자형 막대 모양의 구조를 특징으로 하는 기저 세포 슬라이드 홀더로 보완됩니다.

그림 2에 따르면, 공동 배양 조건(

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토론

자궁내막 기질 세포와 상피 세포의 간접 공동 배양을 위해 단순화되고 비용 효율적인 프로토콜이 설명됩니다. 이 방법은 표준 12웰 세포 배양 플레이트에 부착할 수 있도록 맞춤화된 상부 지지 링으로 구성된 세포 슬라이드용 수제 스캐폴드를 사용하며, 4개의 L자형 막대 모양의 구조를 특징으로 하는 기저 세포 슬라이드 홀더로 보완됩니다. 이 설정은 자궁내막 기질 세포...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme