מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

Summary

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

Abstract

השתלת העובר מושפעת מהאינטראקציות בין סוגי תאים שונים בממשק האם-עובר. התקשורת הישירה והעקיפה בין סוגי תאים שונים בתוך הדצידואה חיונית לוויסות קליטת רירית הרחם; עם זאת, המנגנונים המולקולריים המתווכים אינטראקציה זו עדיין אינם ברורים. בהקשר זה, יש צורך במודל לחקר תהליך ההשתלה כדי לבסס מודל מקיף במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של אינטראקציה בין אפיתל לסטרומה של רירית הרחם. מודל זה מורכב מלוחות תרבית תאים רגילים ופיגום תואם, שנוצר על ידי הדפסה תלת מימדית (תלת מימד) מחומרים בעלות נמוכה. כאן, אנו מפרטים קבוצה של פרוטוקולים לבניית מודל, הכנת תאים, זריעת תאים, תרבית תאים, תצפית והערכה. יתר על כן, כללנו תוצאות מייצגות עם תאים המציגים תנאי גידול טובים תחת המיקרוסקופ. מחקר זה נועד לפתח מודלים במבחנה שיחקו את האינטראקציה בין תאי סטרומה של רירית הרחם לתאי אפיתל, כמו גם בין תאי טרופובלסטים לתאי רירית הרחם.

Introduction

למרות מחקר מקיף על הריון אנושי, המנגנונים המולקולריים בממשק האם-עובר במהלך ההשתלה וההריון המוקדם נותרו לא מובנים היטב^. רירית הרחם האנושית מורכבת בעיקר משני סוגי תאים: תאי אפיתל רירית הרחם (EECs) ותאי סטרומה של רירית הרחם (ESCs). ההשתלה מתקדמת בשלושה שלבים: הצמדה, התקשרות ופלישה, המובילים להתפתחות עובר מוכשר ורירית רחם קולטת². בהתחשב באילוצים האתיים של מחקרי in vivo על נבדקים אנושיים, כמו גם הקשיים בהדמיית המצב האנושי בבעלי חיים באופן מלא, בניית מודלים של תרבית רירית הרחם האנושית במבחנה הפכה לאמצעי יעיל לשכפול^תהליכי ההשתלה וההריון המוקדם. מודלים אלה הם בעלי ערך בחקירת הריונות נורמליים ופתולוגיים כאחד ומספקים פלטפורמה בסיסית לבדיקה ראשונית ואימות של התערבויות טיפוליות ברפואה תרגומית.

תאים מסחריים נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי תאי. תאים אלה מציעים תובנות חשובות לגבי נדידת תאים ודיבור צולב בין סוגים שונים של תאים. עם זאת, תאים מסחריים הם בדרך כלל חד פעמיים ויכולים להיות יקרים⁴.

מספר רב של מודלים של תרבית אנושית במבחנה המורכבים מרירית הרחם ובלסטוציסט, או פונדקאיות בלסטוציסט, פותחו כדי להבין טוב יותר את תהליך ההשתלה המפורט. עם זאת, מודלים אלה עדיין בשלב הראשוני של היישום שלהם מכיוון שהמבנה התלת-ממדי הוא מערך ניסיוני מסובך ביותר, ומדיות בידול ספציפיות מסוימות יקרות ^5,6,7.

השימוש בחומרה להדפסת תלת מימד במחיר סביר ותקופת ייצור קצרה יחסית מאפשר להתאים מבנים למטרות ניסוי שונות. טכניקות הדפסת תלת מימד עוזרות להפחית את עלויות הזמן ומאפשרות יצירת מבנים מורכבים ומותאמים אישית. טכנולוגיה זו מאיצה משמעותית את העיצוב והאיטרציה של אב טיפוס, מה שהופך אותה לכלי רב ערך עבור חוקרים בתחומים שונים, ומאפשרת להם להשלים את עבודתם בצורה יעילה יותר ^8,9,10.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ניסיוני אפשרי וחסכוני לבניית המבנה התלת מימדי והשימוש בו כמערכת תרבית תאים, שיכול לדמות את האינטראקציה בין תאי סטרומה של רירית הרחם ותאי אפיתל לחקירת קליטת רירית הרחם במהלך השתלת העובר. זה מספק אלטרנטיבה הניתנת להתאמה אישית ובעלות נמוכה לחומר חד פעמי מסחרי.

Protocol

הערה: ניתן למצוא את כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה בטבלת החומרים. אלא אם צוין אחרת, כל המדיה אוזנה מראש ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

1. 3D הדפסת הפיגום ובניית הדגם

הערה: השלבים כאן בוצעו על פי ספר ההוראות של מכונת הדפסת מתכת תלת מימדית מסחרית. השלבים מתוארים בקצרה להלן (קובץ משלים 1).

1. פילוס מיטת הדפסה
   1. הקש על סמל התפריט בלוח המחוונים ונווט אל כלי עזר. בחר מפלס מיטה כדי להתחיל את שגרת הרמה.
   2. הסר את גיליון ההדפסה ממיטת ההדפסה ובחר סיום. מיטת ההדפסה תעלה לגובהה המרבי לקראת פילוס. ברגע שמד ההתקדמות מגיע ל-100%, לחץ על התחל.
   3. אם מדפסת Metal X לא יושרה בעבר, בחר איפוס. אם כן, בחר דלג והמשך ישירות לשלב 1.1.5 (סריקה של 16 נקודות).
   4. השתמש במפתח משושה 2.5 מ"מ כדי לסובב את כל ברגי הרמה של שלוש המיטות בכיוון השעון עד שהם מהודקים. לאחר מכן, שחרר אותם על ידי סיבוב נגד כיוון השעון שני סיבובים מלאים כדי להגדיר אותם בגובה נקודת האמצע. לחץ על סיום כדי להמשיך.
   5. המדפסת תסרוק את המיטה ב-16 נקודות ייעודיות. הימנע מלגעת במיטה או במסגרת במהלך תהליך זה. לאחר שההתקדמות מגיעה ל- 100%, לחץ על הבא.
2. יישום גיליון הדפסה
   1. הסר שאריות מתכת או פסולת תמיכה. העבר את מחוון הוואקום למצב מופעל.
   2. הניחו למיטה להנמיך ולהתחמם, ולאחר מכן לחצו על הבא. הנח את גיליון ההדפסה מעל רשת הוואקום ולחץ על הבא.
   3. מקם את מכבש הגיליון מעל גיליון ההדפסה, ויישר אותו עם מסילות ה-Z בחלק האחורי של החדר.
   4. המתן עד שהוואקום יתחבר וייצור אטימה יציבה. לאחר הפעלת הוואקום, לחץ על סיום.
3. העמסת חוטי מתכת
   1. מקם ידנית את ראש ההדפסה במרכז אזור ההדפסה. הסר את מכסה ראש ההדפסה על ידי החלקתו כלפי מעלה ומחוץ לברגי ההרכבה.
   2. הקש על סמל התפריט בלוח האפשרויות. בחר חומרים מתוך האפשרויות.
   3. בחר Load Metal כדי להתחיל את שגרת הטעינה. בחר טעינה מהירה.
   4. בחר את הסוג הספציפי של חומר המתכת לטעינה (למשל, אלומיניום 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. הנח את הסליל על המחזיק ולחץ על הבא. סגור את הדלת ואפשר לסלילים להתחמם, ולאחר מכן לחץ על הבא.
   6. הכנס את החומר לכניסה הקדמית של ראש ההדפסה (מסומן M) עד שהמכבש יתחיל למשוך אותו דרכו.
4. הדפסת חלקי מתכת
   1. בחלונית Printing Settings, לחץ על Export Build. שמור את הקובץ בכונן USB בפורמט FAT32 והכנס אותו למדפסת.
   2. בחר את סמל התפריט בלוח. נווט אל אחסון ובחר הדפס מהאחסון. בחר את קובץ החלק כדי להתחיל בהדפסה.
5. הסרת חלקי מתכת
   1. החלק בזהירות את גיליון ההדפסה ואת החלקים המודפסים ממיטת ההדפסה. נתק בעדינות את החלקים מגיליון ההדפסה. הסדין הגמיש צריך להתקלף בקלות.

2. הכנה לתרבית תאים במודל תלת מימד

הערה: מומלץ להשתמש בחומרים עמידים בטמפרטורה גבוהה כחומרים מתכלים להדפסת תלת מימד תומכי פיגום כיסוי תאים כדי להקל על עיקור החיטוי לפני כל שימוש בניסויים בתרבית תאים. במחקר זה נעשה שימוש בתאי סטרומה של רירית הרחם האנושית (HESC) ותאי אפיתל רירית הרחם האנושיים (אישיקאווה). אפיון קווי התאים הללו דווח בעבר ^5,6.

1. תרבית תאים ומעבר
   1. הכן 50 מ"ל של מדיום משלים ל-hESC על ידי הוספת DMEM/F12 בינוני + 2 מ"מ L-גלוטמין + 10% סרום בקר עוברי (FBS) ללא פחם + 1% תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין.
   2. הכן 50 מ"ל של מדיום משלים לאישיקאווה על ידי הוספת מדיום הנשר המותאם של Dulbecco + 10% FBS + 1% תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין.
   3. הפשרת תאים
      הערה: קו התאים שנרכש נשלח על קרח יבש במצב קפוא. יש לאחסן אותו בשלב האדים של חנקן נוזלי או מתחת ל-130 מעלות צלזיוס.
      1. הכן את כל הציוד המעוקר ואנזים הדיסוציאציה הדרושים, וחמם את המדיום המשלים ל -37 מעלות צלזיוס.
      2. הפשירו את התאים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין מדי פעם. העבירו את תרחיף התא לצינור המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
      3. הסר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב -5 מ"ל של מדיום תרבית שלם מוכן והוציאו אותו לשתי צלוחיות תרבית T25. תרבית התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
2. הכנת תאים עם כיסוי
   1. השתמש בכיסוי מרובע של 18 מ"מ כמשטח תרבית התאים; ודא שהכיסוי נקי וסטרילי.
   2. מצפים את הכיסוי בתחתית צלחת של 12 בארות ב-200 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית (ECM) בריכוז של 200-300 מיקרוגרם/מ"ל. שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   3. הסר את ה-ECM מהצלחת. בדוק את התאים לאיתור מפגש מתאים, וודא שהצפיפות של שני קווי התאים היא בסביבות 70%-80%
   4. הסר את המדיום המושקע ושטוף את התאים עם 3 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) פי 2.
   5. הוסף 2 מ"ל של אנזים דיסוציאציה ותרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לנתק אותם.
   6. לנטרל עם מדיום תרבית שלם וליצור מתלה חד תאי על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
   7. קח 100 מיקרוליטר מתרחיף התא וערבב עם טריפן כחול (גורם דילול = 2).
   8. החלק את הכיסוי מעל תא ההמוציטומטר. מלאו את שני התאים הצדדיים במתלה התאים המכיל טריפאן כחול.
   9. ספרו את מספר התאים בריבועים משני הצדדים תחת מיקרוסקופ פי 20 וחשבו את צפיפות התאים.
   10. מעבירים את התאים לצלחת המוכנה עם מדיום טרי ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. זרע hESC לבאר בטמפרטורה של 1 x 10⁵ תאים/מ"ל למשך 24 שעות.
   11. עבור קו התאים של אישיקאווה, זרע את התא לבאר ללא כיסוי למחרת.

3. הרכבת מודל התרבות המשותפת

1. משרים היטב את הפיגומים באלכוהול אתילי ומים מזוקקים כפולים (ddw) למשך יומיים. יש לעקר פיגומים עם חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולייבש אותם.
2. הוסף כ-2 מ"ל של מדיום משלים לקו התאים של אישיקווה לבאר המטפח אישיקאווה, וודא שמפלס הנוזל מכסה את הכיסוי.
3. העבירו את מכסה הכיסוי עם hESC על הפיגום ושמרו את הצד עם התא כלפי מטה. חברו את הפיגום לאישיקאווה המתורבת היטב. עבור הסט השני, הפוך את הסידור הזה על ידי העברת מכסה הכיסוי עם אישיקאווה על הפיגום וחיבור הפיגום ל-hESC המתורבת היטב. השתמש בתאים ללא מערך הפיגום לניתוח צמיחת תאים הגדלים באופן עצמאי.
4. דגירה של מערכת התרבות המשותפת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. תקופת התרבות המשותפת יכולה להשתנות בהתאם לתכנון הניסוי, אך בדרך כלל נעה בין 24-72 שעות.

4. רכישת תמונות

1. הסר בזהירות את מדיום התרבית ושטוף את התאים בעדינות עם מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS).
2. הסר כיסויים עם תאים מחוברים מכלי התרבות בעזרת מלקחיים עדינים או פינצטה. לחלופין, הניחו כיסויים בכלי חדש עם PBS כדי למנוע ייבוש במהלך ההעברה.
3. קח שקופית מיקרוסקופ נקייה והניח טיפה של PBS. העבר בעדינות את תאים המכילים את הכיסוי על טיפת מדיום ההרכבה, וודא שהתאים פונים כלפי מטה אל השקופית.
4. הנח את השקופית המוכנה על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך. בחר את עדשת המטרה המתאימה (למשל, 10x, 20x) והתאם את המיקוד באמצעות כפתורי מיקוד גסים ועדינים.
5. הגדר פרמטרים של מיקרוסקופ כגון עוצמת תאורה והגדרות מצלמה. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, צלמו תמונות של התאים בהגדלות ובשדות הראייה הרצויים. התאם את זמן החשיפה והגדרות הדמיה אחרות כדי למטב את איכות התמונה.

5. עיבוד תמונה

1. לחצו על 'פתח' לפתיחת התמונה, לחצו על 'עבד' > 'מסננים > שיפור' כדי > בחרו 'השוואה מקומית' ולחצו על 'החל'.
2. לחץ על Edit > Convert To > Gray Scale 8. לחצו על 'שיפור', בחרו 'החל ניגודיות'.
3. לחץ על ספור ומדוד נושאים. לחץ על ידני, בחר טווח והתאם את ההיסטוגרמה כדי לוודא שכל התאים מכוסים.
4. לחצו על 'החל מסיכה', סגרו את החלון הנוכחי, לחצו על 'אובייקטים בהירים אוטומטיים' >'מדידה', בחרו 'מדידה' ובחרו 'אווירה ', 'דנדריק', 'צפיפות וגודל'.
5. לחץ/י על ״אובייקטים בהירים אוטומטיים״ ולאחר מכן לחץ/י על ״ספירה״. לוחצים על ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני המדידה לגיליון אלקטרוני.

6. קצירת תאים

1. הסר את הכיסויים משקופית המיקרוסקופ והעביר אותם לבאר נקייה ויבשה.
2. קצור את תא אישיקווה עם ריאגנט בידוד RNA לטרנסקריפטומי או ריאגנט ליזה של ריפאה למחקר פרוטאומי.
   הערה: עבור hESC, שיטת תרבית הכיסוי הייתה יעילה יותר לצילום תמונה לאחר צביעה חיסונית. לחלופין, ניתן לקצור את ה-hESC עם ריאגנט בידוד RNA או ריאגנט ליזה של Ripa. ניתן להחליף קווי תאים שגודלו על הכיסוי או על פני הלוח; עם זאת, אנו ממליצים לזרוע את התאים שהוכנו לניתוח הדמיה על הכיסוי.

תוצאות

איור 1 מציג את הפיגום הביתי לשקופיות תאים המשמשות בתהליך זה, הכולל טבעת תמיכה עליונה המותאמת לחיבור ללוחות תרבית תאים סטנדרטיים של 12 בארות, בתוספת מחזיק שקופיות תא בסיסי הכולל ארבעה מבנים דמויי מוט בצורת L.

על פי איור 2, הצפי?...

Discussion

מתואר פרוטוקול פשוט וחסכוני לתרבית משותפת עקיפה של תאי סטרומה ואפיתל של רירית הרחם. שיטה זו משתמשת בפיגום תוצרת בית לשקופיות תאים, הכולל טבעת תמיכה עליונה המותאמת לחיבור ללוחות תרבית תאים סטנדרטיים של 12 בארות, בתוספת מחזיק שקופיות תא בסיס הכולל ארבעה מבנים דמויי מוט בצו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme