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Resumen

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

Resumen

La glicosilación es una modificación proteica común y estructuralmente diversa que afecta a una amplia gama de procesos tumorigénicos. La glicómica y la glicoproteómica impulsadas por espectrometría de masas han surgido como enfoques poderosos para analizar los glicanos liberados y los glicopéptidos intactos, respectivamente, ofreciendo una comprensión más profunda del glicoproteoma heterogéneo en el microambiente tumoral (TME). Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada, que emplea en primer lugar glicómicos porosos basados en carbono grafitizado LC-MS/MS para dilucidar las estructuras de glicanos y su distribución cuantitativa en el glicoma de tejidos tumorales, poblaciones celulares o fluidos corporales que se están investigando. Esto permite un análisis glucómico comparativo para identificar la glicosilación alterada en grupos de pacientes, etapas de la enfermedad o condiciones y, lo que es más importante, sirve para mejorar el análisis glucoproteómico posterior de las mismas muestras mediante la creación de una biblioteca de estructuras de glicanos conocidas, reduciendo así el tiempo de búsqueda de datos y la tasa de identificación errónea de glicoproteínas. Centrándonos en el perfil del N-glicoproteoma, en este protocolo se detallan los pasos de preparación de la muestra para el método de glicoproteómica guiado por glucómicos, y se discuten los aspectos clave de la recopilación y el análisis de datos. El método de glicoproteómica guiado por glucómica proporciona información cuantitativa sobre las glicoproteínas presentes en el TME y sus sitios de glicosilación, la ocupación del sitio y las estructuras de glicanos específicas del sitio. Se presentan resultados representativos de tejidos tumorales fijados en formol e incluidos en parafina de pacientes con cáncer colorrectal, lo que demuestra que el método es sensible y compatible con las secciones de tejido que se encuentran comúnmente en los biobancos. Por lo tanto, la glicoproteómica guiada por glucomica ofrece una visión integral de la heterogeneidad y la dinámica del glicoproteoma en TME complejos, generando datos bioquímicos sólidos necesarios para comprender mejor la glucobiología de los cánceres.

Introducción

La glicosilación de proteínas es un tipo frecuente y complejo de modificación traslacional y postraduccional de proteínas producidas por especies a lo largo del árbol filogenético de la vida 1,2,3. Se sabe que los glicanos ligados a proteínas influyen en una amplia gama de procesos biológicos importantes para la salud humana, incluida la mediación y regulación de las interacciones celulares y los eventos de comunicación 4,5. Se ha pensado que la glicosilación aberrante de proteínas es una causa de transformación maligna, progresión tumoral y diseminación 6,7,8. Esto implica a los glicanos en procesos tumorales clave en el microambiente tumoral (TME) y ofrece un potencial considerable y en gran parte sin explotar para el descubrimiento de biomarcadores basados en glicanos y aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, la glicobiología está recibiendo cada vez más atención en la investigación del cáncer y en las ciencias de la vida9.

Impulsados por los desarrollos clave en glicoanalítica e informática durante la última década 10,11,12,13,14,15,16,17, la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) impulsada por glucómica y glicoproteómica se han establecido como herramientas poderosas para el perfil de todo el sistema de glicanos liberados y glicopéptidos intactos a partir de mezclas complejas de glicoproteínas extraídas directamente de los orígenes de sus muestras biológicas, como varios tipos de muestras de pacientes con cáncer (por ejemplo, tejidos tumorales, poblaciones de células, fluidos corporales)3,13,18,19,20.

La glicomica proporciona información sobre la estructura y la cantidad del repertorio de glicanos (el glicome), que es producido dinámicamente por células, tejidos e incluso organismos completos. Por otro lado, la glicoproteómica proporciona información cuantitativa sobre los transportadores de proteínas y su(s) sitio(s) de glicosilación, las tasas de ocupación del sitio (macroheterogeneidad), las composiciones de glicanos específicas del sitio y su patrón de distribución del sitio (microheterogeneidad) con información estructural de glicanos limitada (a menudo limitada a la composición de glicanos)15,16,21. Por lo tanto, la glucómica y la glicoproteómica son enfoques complementarios para estudiar los detalles bioquímicos del glicoproteoma22.

Se han desarrollado y aplicado en todos los laboratorios una miríada de diseños metodológicos y estrategias analíticas para la glucómica y la glicoproteómica en función del glicoanalito de interés (por ejemplo, ligado a N-/O-/C, glicano/glicopéptido/glicoproteína, marcado/no marcado), la naturaleza de la muestra (p. ej., células, tejidos, fluidos corporales), la cantidad (niveles de proteínas de nanogramos/microgramos/miligramos) y el instrumento analítico disponible23. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. A pesar de los beneficios reconocidos de su uso paralelo, la glicómica y la glicoproteómica no se aplican comúnmente juntas, sino más bien como enfoques independientes en los estudios de investigación glicobiológica y oncológica debido a su alta demanda de experiencia analítica e instrumentación especializada.

Reconociendo esta brecha tecnológica, hace más de una década, introdujimos el método de glicoproteómica asistida por glucómica, que es capaz de integrar datos glucómicos y glicoproteómicos obtenidos de especímenes biológicos complejos33. En resumen, la tecnología de glicoproteómica asistida por glucómica (o guiada por glucómica como en este protocolo) perfila los N- y/o O-glicanos a través de un método LC-MS/MS de carbono grafitizado poroso (PGC)establecido34,35, que luego se utilizan para el análisis de datos de Nglicopéptidos y/o O-glicopéptidos intactos adquiridos de la(s) misma(s) muestra(s) definiendo los límites del espacio de búsqueda de glicanos36. PGC-LC-MS/MS es un método glucómico particularmente poderoso, ya que proporciona información cuantitativa sobre el glicoma con alta sensibilidad y resolución estructural, proporcionando información sobre la topología (secuencia de monosacáridos y patrón de ramificación) y los enlaces glucosídicos de los glicanos incluso dentro de mezclas complejas 35,37,38. El flujo de trabajo de glicoproteómica implica la generación de péptidos, el etiquetado opcional de péptidos, la multiplexación y el prefraccionamiento, así como el enriquecimiento antes del análisis LC-MS/MS de fase reversa que idealmente emplea diferentes métodos de fragmentación, incluida la energía de colisión escalonada/disociación colisional de mayor energía (sceHCD, para N-glicopéptidos) y la transferencia de electrones/disociación colisional de mayor energía (EThcD, para O-glicopéptidos) para la identificación de analitos. Para el análisis de N-glicoproteoma, la de-N-glicoproteómica paralela puede guiar el análisis de datos de N-glicopéptidos intactos definiendo el espacio de búsqueda proteína/péptido y proporcionando más detalles sobre los sitios de N-glicosilación ocupados y su tasa de ocupación del sitio, mientras que el análisis paralelo de péptidos no modificados revela cualquier cambio en el nivel de proteína entre las condiciones estudiadas.

Este documento proporciona un protocolo paso a paso detallado y fácil de seguir para el método de glicoproteómica guiado por glucomicas (consulte la Figura 1 para obtener una descripción general del flujo de trabajo). El protocolo proporciona detalles experimentales de los pasos de preparación de la muestra y los experimentos de glicomica y glicoproteómica basados en LC-MS/MS, y presenta resultados representativos que demuestran la aplicación del método a secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) de tumores resecados de pacientes con cáncer colorrectal (CCR), lo que permite comprender la glicobiología del TME en un valioso tipo de muestra que se archiva en biobancos de cáncer de todo el mundo. También se discute brevemente el análisis y la integración de datos glucómicos y glicoproteómicos.

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Figura 1: Descripción general del método de glicoproteómica guiado por glucomica. La descripción general muestra los pasos experimentales detallados en los flujos de trabajo de glucómica (izquierda) y glicoproteómica (derecha), con una descripción general de la información obtenida (en negrita) y cómo se integran los dos enfoques a través de un mejor análisis e interpretación de datos. Inserto: Microcolumnas de SPE de fabricación casera utilizadas para los flujos de trabajo de (i) glucómica y (ii-iii) glicoproteómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos (Ciencias Médicas) de la Universidad Macquarie, Sydney, Australia (Protocolo 5201800073).

NOTA: El método de glicoproteómica guiado por glucómica se puede aplicar a un conjunto diverso de muestras biológicas que van desde una complejidad glicoproteica baja hasta una extrema complejidad. En el caso de los enfoques de glicoproteómica sin marcadores (en los que no se realiza la agrupación de muestras), se requieren aproximadamente 100-200 μg de proteína total de mezclas complejas como material de partida para garantizar una alta cobertura de glicoproteoma después del enriquecimiento de glicopéptidos que solo pueden constituir el 1%-10% de la población de péptidos. Debido a las limitaciones de espacio, se omite la extracción inicial de proteínas de las células o tejidos, y se remite a los lectores a otros recursos15. Glycomics consume de forma conservadora ~10-20 μg de proteína por análisis para la elaboración de perfiles profundos de glicoma, dejando la mayor parte del extracto de proteína para la glicoproteómica. Si no se indica lo contrario, se han mencionado las concentraciones finales y los productos químicos deben disolverse en agua de ultra alta calidad para hacer soluciones acuosas en el protocolo a continuación.

1. Preparación de proteínas

  1. Determine la concentración de proteínas de los extractos utilizando un método establecido (por ejemplo, ensayos de ácido bicincónico o proteínas de Bradford). Ajuste la concentración de proteína a 10 μg/μL en 50 mM de TEAB (pH 8,5).
  2. Reduzca los enlaces disulfuro incubando muestras con 10 mM de DTT durante 45 min a 56 °C. Grupos tioles libres de alquilatos mediante la incubación posterior de muestras con 40 mM de IAA en la oscuridad durante 30 min a 20-25 °C. Apagar la reacción de alquilación con exceso de DTT (~40 mM).
  3. Divida cada muestra de proteína. Permita aproximadamente 10-20 μg de proteína total para la glucómica y 100-200 μg de proteína total para el flujo de trabajo de glicoproteómica.
    NOTA: Además de la(s) muestra(s) de proteína(s) de interés, incluya un modelo conocido de glicoproteína (p. ej., fetuina bovina) o mezcla de proteínas (p. ej., lisado de línea celular, plasma) para evaluar la eficiencia y la reproducibilidad de los procedimientos y para monitorear el rendimiento de LC-MS/MS.

2. Flujo de trabajo de N-glycomics

  1. Inmovilización de proteínas en una membrana de PVDF
    1. Utilice una perforadora de un solo orificio para cortar el accesorio de membrana de PVDF con el número de muestras de proteínas que se van a detectar.
    2. Humedece las membranas extirpadas con etanol o metanol, luego transfiere las membranas a una placa de fondo plano de 96 pocillos.
    3. Una vez que las membranas estén casi secas, deposite las muestras de proteína en un volumen máximo de 2,5 μL por punto para minimizar el área de superficie de la muestra de proteína depositada. Vuelva a localizar las muestras si es necesario para que la cantidad total de proteína inmovilizada en el lugar sea de ~ 10-20 μg. Para hacer esto, deje que la mancha se seque al aire antes de repetir el procedimiento de manchado.
      NOTA: Durante el manchado, puede ser necesario volver a humedecer la membrana con etanol o metanol para evitar que las membranas se sequen hasta su finalización.
    4. Secar las membranas al aire a 20-25 °C durante al menos 3 h, preferiblemente durante la noche. Evite cualquier contaminación de las membranas durante el secado.
      NOTA: Como paso opcional de control de calidad, las proteínas detectadas en las membranas se pueden visualizar mediante tinción con la solución Direct Blue 71 como se describió anteriormente34.
  2. Liberación de N-glicanos ligados a proteínas
    1. Agregue 100 μL de PVP40 al 1% (p/v) en metanol a cada pocillo que contenga las membranas manchadas. Asegúrese de que el lado de la membrana en el que se detectó la muestra de proteína esté orientado hacia arriba durante toda la preparación de la muestra.
    2. Agite la placa en la solución PVP40 durante 5 minutos a 20-25 °C, luego deseche la solución PVP40.
      NOTA: La solución de PVP40 bloquea las membranas de PVDF y los pocillos para evitar la unión inespecífica de la PNGasa F (y cualquier exoglicosidasa que se pueda aplicar para lograr información específica de enlace en experimentos paralelos; consulte la discusión a continuación) en los pasos siguientes.
    3. Lave cada pocillo que contenga las manchas de proteínas bloqueadas con 100 μL de agua ultrapura y agite el plato durante 5 minutos. Repita este paso 3 veces. Asegúrese de que el agua se deseche por completo después de cada lavado.
    4. Añadir 15 μL de solución de PNGasa F (0,5 U/μL, diluida en agua ultrapura de la solución madre de 10 U/μL) a cada pocillo, suponiendo que se han depositado 15 μg de proteína por muestra.
    5. Agregue agua a los pozos vacíos circundantes para evitar la deshidratación de la muestra durante los pasos posteriores de la incubación, y use una película transparente para sellar la placa con cuidado. Incubar la placa durante al menos 8 h a 37 °C.
    6. Sonicar la placa durante 5 minutos para ayudar a que las gotas evaporadas en el costado de los pocillos se acumulen en el fondo de la placa.
    7. Transfiera cuidadosamente las muestras de N-glicanos liberadas a tubos de microcentrífuga individuales (1,5 mL). Lave los pocillos de muestra 2 veces con 20 μL de agua ultrapura y dispense y aspire varias veces. Combine cualquier muestra restante de cada pocillo en los tubos de microcentrífuga que contienen las muestras de N-glicanos.
      NOTA: Evite el uso de tubos de baja unión para la preparación de la muestra de N-glicómica, ya que los glicanos hidrofílicos pueden unirse irreversiblemente a los tubos recubiertos.
    8. Añadir 10 μL de acetato de amonio 100 mM pH 5,0 e incubar las muestras durante 1 h a 20-25 °C.
      NOTA: Este paso hidroxiliza los residuos de N-acetilglucosamina aminados en el extremo reductor de los N-glicanos liberados, lo que permite una reducción exhaustiva en el paso siguiente. Ajuste 100 mM de acetato de amonio a pH 5.0, ya que las altas tasas de conversión de glicosilamina a hidroxilo en el extremo reductor de los N-glicanos desprendidos dependen de la acidez débil de la solución.
    9. Seque las muestras de N-glicanos en un sistema concentrador de vacío.
  3. Reducción de los N-glicanos liberados
    1. Añadir 20 μL de NaBH1 M 4 en 50 mM KOH recién preparado a las muestras de N-glicanos secos y mezclar bien.
      NOTA: NaBH4 debe estar recién preparado en KOH el día en que se utiliza.
    2. Cierre herméticamente las tapas de cada tubo e incube las muestras durante 3 h a 50 °C.
      NOTA: Los N-glicanos se someten a una reducción, que convierte los α y β anómeros del extremo reductor en una sola forma de alditol, lo que conduce a un solo pico cromatográfico en el análisis PGC-LC-MS/MS.
    3. Después de la incubación, haga girar los tubos de muestra en una microcentrífuga para llevar el líquido al fondo de los tubos.
    4. Añadir 100 μL de agua ultrapura a cada muestra. Añadir 2 μL de ácido acético glacial para neutralizar las muestras alcalinas de N-glicanos. Haga girar los tubos de muestra en una microcentrífuga para llevar las muestras al fondo de los tubos.
      NOTA: El ácido acético glacial neutraliza las muestras alcalinas, lo que conduce a la formación de gas hidrógeno (H2) y la posterior efervescencia durante la reacción.
  4. Desalinización de N-glicanos mediante PGC-C18-SPE
    1. Prepare microcolumnas PGC-C18-SPE caseras como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C18 a las puntas de pipeta adecuadas (10 μL).
        NOTA: En este caso, también se pueden utilizar microcolumnas comerciales C18-SPE.
      2. Pipetear 10 μL de lechada de resina PGC suspendida en metanol al 50% (v/v) en las microcolumnas C18-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 ml equipados con adaptadores de microcentrífuga. Gire los tubos para crear microcolumnas PGC-C18-SPE con una altura de columna de ~0,5 cm (consulte la Figura 1i). Prepare una microcolumna PGC-C18-SPE para cada muestra.
        NOTA: El uso de adaptadores asegura que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo.
      3. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para facilitar el paso de las fases móviles a través de las microcolumnas PGC-C18-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna PGC-C18-SPE secuencialmente con 50 μL de TFA al 0,1% (v/v) en ACN tres veces, seguido de 50 μL de TFA al 0,1% (v/v) tres veces.
        NOTA: Las microcolumnas PGC-SPE se pueden preparar con horas de anticipación, pero deben almacenarse hidratadas a temperatura ambiente antes de su uso.
    2. Aplique las muestras de N-glicanos a las microcolumnas PGC-C18-SPE en un volumen de carga de hasta 40 μL y centrifuga a 6.000 rpm (~2.000 x g) durante 60 s después de cada adición. Repita el paso de carga hasta que toda la muestra de N-glicano se haya aplicado a la microcolumna.
      NOTA: Si bien las fracciones de flujo no deben contener glicanos, recomendamos conservar estas fracciones hasta que los datos de glucómica se hayan adquirido con éxito en caso de retención incompleta en las microcolumnas PGC-C18-SPE.
    3. Lave las microcolumnas PGC-C18-SPE con 20 μL de agua ultrapura. Transfiera las microcolumnas PGC-C18-SPE a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en preparación para la elución de N-glicanos.
    4. Eluir los N-glicanos añadiendo 40 μL de AGT al 0,1 % en ACN al 50 % (ambos v/v) a cada microcolumna PGC-C18-SPE y, a continuación, centrifugar. Repita este procedimiento y combine el eluido.
      NOTA: Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    5. Seque los N-glicanos desalados en un sistema concentrador al vacío.
  5. Adquisición de PGC-LC-MS/MS
    1. Prepare los disolventes LC como se describe a continuación.
      1. Disolvente A: Preparar 100 mL de solución madre de bicarbonato amónico (NH4HCO3) de 100 mM en agua ultrapura. Filtre la solución madre a través de un disco de filtro de nailon de 0,2 μm utilizando una unidad de filtración al vacío para eliminar las partículas. A continuación, prepare 1 L de 10 mM de solución de NH4HCO3 (disolvente A) diluyendo 100 mL de solución madre de 100 mM de NH4HCO3 en 900 mL de agua ultrapura. Sonicar el disolvente A durante 15 min para desgasificar la solución. El disolvente A puede almacenarse durante 1 semana a 20-25 °C, mientras que la solución madre de 100 mM de NH4HCO3 puede almacenarse durante 1 mes a 4 °C.
      2. Disolvente B: Preparar 1 L de 10 mM de NH4HCO3 al 70% (v/v) de ACN en agua ultrapura (disolvente B) añadiendo 100 mL de solución madre de NH4HCO3 100 mM (véase el paso anterior 2.5.1.2) a 700 mL de ACN y diluir hasta un volumen total de 1 L con agua ultrapura. Sonicar el disolvente B durante 15 min para desgasificarlo. El disolvente B puede almacenarse durante 2 semanas a 20-25 °C.
    2. Vuelva a suspender los N-glicanos desalados en 10 μL de agua ultrapura y mezcle bien. Centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 5 minutos, luego transferir cuidadosamente el sobrenadante a los viales de muestra MS, dejando aproximadamente 0,5 μL para evitar transferir partículas y residuos visibles o invisibles que dañarían el sistema LC-MS/MS.
    3. Inyecte y separe los N-glicanos en una columna capilar PGC-LC calentada a 50 °C utilizando un gradiente lineal de 60 minutos (o de otro modo apropiado) de 0%-70% (v/v) de solvente B en solvente A en un sistema de HPLC. Asegúrese de que el sistema HPLC esté conectado al espectrómetro de masas y funcione con un caudal constante de 20 μL/min (ajuste el caudal para que coincida con la geometría de la columna PGC-LC).
    4. Detecte los N-glicanos separados utilizando un espectrómetro de masas cuadrupolar de trampa de iones lineal (u otro sistema MS adecuado de baja o alta resolución) instalado con una fuente de iones de electrospray y que funcione en modo de polaridad de iones negativos.
    5. Establezca el rango de escaneo de adquisición MS1 en m/z 150-2,000 con un ancho de pico de escaneo de zoom de m/z 0.25 y ancho completo medio máximo (FWHM) en m/z 200. Ajuste el voltaje de la fuente a 3,2 kV. Para escaneos MS1, configure el control automático de ganancia (AGC) en 5 x 104 iones con un tiempo de acumulación máximo de 50 ms (o cualquier otra configuración adecuada).
      NOTA: El m/z inicial bajo debe incluir la detección de monosacáridos y diacáridos que a menudo contribuyen al N- y O-glicoma.
    6. Para MS/MS, establezca la resolución en m/z 0,25 FWHM a m/z 200, el AGC en 2 x 104 iones y el tiempo máximo de acumulación en 300 ms. Habilite la adquisición dependiente de datos (DDA) y seleccione los cinco precursores más abundantes en cada escaneo completo de MS1 para la fragmentación mediante la disociación inducida por colisión (CID) de activación por resonancia (trampa de iones) a una energía de colisión normalizada (NCE) del 33 %. Anule la selección de la exclusión dinámica para evitar que pasen por alto los isómeros de N-glicanos isobáricos de elución cercana.
  6. Análisis de datos de LC-MS/MS glicomicas
    1. Examine los datos brutos de LC-MS/MS generados utilizando el software adecuado para garantizar una alta calidad de los datos después de confirmar el estrecho ancho de pico de LC, la separación eficaz de isómeros N-glicanos, la alta precisión, resolución y relación señal-ruido de la MS, y la alta eficiencia de fragmentación de CID-MS/MS.
    2. Identifique manualmente los N-glicanos en la muestra en función de su masa precursora monoisotópica, el patrón de fragmentación de CID-MS/MS y el tiempo de retención relativo y absoluto de PGC-LC.
      NOTA: RawMeat v2.1, GlycoMod y GlycoWorkBench v2.1 pueden ayudar en el proceso de identificación como se describe26. Las restricciones biosintéticas conocidas y la relación estructural entre los analitos observados también pueden añadir más confianza en los N-glicanos identificados26. Alternativamente, la identificación semiautomática de glicanos y la anotación espectral se pueden realizar utilizando software comercial.
    3. Para la cuantificación relativa de N-glicanos, genere una lista de transición que contenga el precursor monoisotópico m/z de todos los isómeros de N-glicanos identificados y utilice un software comercial para determinar los valores de área bajo la curva (AUC) basados en cromatogramas de iones extraídos (EIC) de todos los iones precursores de N-glicanos como se describe26.

3. Flujo de trabajo de N-glicoproteómica

  1. Digestión de la mezcla de proteínas
    1. Digiera 100-200 μg del extracto de proteína reducida y alquilada (de la parte 1) añadiendo tripsina (relación enzima:proteína 1:50, p/p) y/u otras proteasas de elección a cada muestra.
      NOTA: A diferencia de la preparación de muestras glicómicas, utilice, si es posible, tubos de microcentrífuga de baja unión para los pasos de preparación de muestras de glicoproteómica para obtener la máxima recuperación de péptidos.
    2. Incubar las muestras durante 8-12 h a 37 °C. Asegúrese de que el pH sea de ~ 8.5 ya que una solución ligeramente alcalina mejora la eficiencia de la digestión de la tripsina.
      NOTA: Se prefieren las proteasas específicas que producen patrones de escisión predecibles y dejan a la mayoría de los N-glicopéptidos con una sola lentejuela (sitio de glicosilación), como la tripsina y el Lys-C. Evite la incubación excesiva de las muestras para reducir las escisiones inespecíficas de proteínas por tripsina u otras proteasas.
    3. Detener la digestión por acidificación (para evitar escisiones inespecíficas inducidas por una digestión prolongada) mediante la adición de 1% (v/v) de TFA.
  2. Desalinización de péptidos con Oligo R3-C18-SPE
    1. Prepare microcolumnas caseras de Oligo R3-C18-SPE como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C18 a puntas de pipeta de 10 μL.
        NOTA: En este caso, también se pueden utilizar microcolumnas comerciales C18-SPE.
      2. Deposite una lechada de resina Oligo R3 suspendida en ACN puro en las microcolumnas C18-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mL equipados con adaptadores de microcentrífuga para asegurarse de que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo y gire para crear microcolumnas Oligo R3-C18-SPE con una altura de columna de ~ 1 cm (consulte la Figura 1ii). Prepare una microcolumna de Oligo R3-C18-SPE para cada muestra.
    2. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para permitir que las fases móviles pasen a través de las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna de Oligo R3-C18-SPE secuencialmente con 50 μL de ACN puro, 3x, y luego 50 μL de 0,1% (v/v) de TFA, 3x.
      NOTA: Las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE pueden prepararse con antelación y almacenarse hidratadas durante horas a temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Coloque las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE acondicionadas en tubos nuevos de 1,5 mL junto con adaptadores de microcentrífuga. Aplique las mezclas de péptidos digeridos trípticos a las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE y centrifuga a 2.000 x g durante 60 s. Es posible que se requieran varias rondas de carga para volúmenes de muestra superiores a 50 μL.
    4. Lavar las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE con 50 μL de TFA al 0,1% (v/v), 3x. Transfiera las microcolumnas de Oligo R3-C18-SPE a nuevos tubos de 1,5 mL en preparación para la elución de los péptidos desalados.
    5. Eluir los péptidos desalados aplicando 50 μL de AGT al 0,1% en NAC al 50% (ambos v/v), seguidos de 50 μL de AGT al 0,1% en ACN al 70% (ambos v/v) a cada microcolumna de Oligo R3-C18-SPE. Gira después de cada paso.
      NOTA: Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    6. Recoja, combine y seque los péptidos desalados en un sistema concentrador de vacío.
      NOTA: Si realiza proteómica paralela y de-N-glicoproteómica (consulte la Discusión), divida las muestras de péptidos desalinizados y reserve fracciones separadas antes de secarlas.
  3. Enriquecimiento de N-glicopéptido mediante ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Prepare microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE caseras como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C8 a puntas de pipeta de 10 μL.
      2. Depositar una lechada de resina ZIC-HILIC suspendida en metanol en las microcolumnas C8-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mL equipados con adaptadores de microcentrífuga para asegurarse de que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo y gire para crear microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE con una altura de columna de ~ 1 cm (consulte la Figura 1iii). Prepare una microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE para cada muestra.
    2. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para permitir que las fases móviles pasen a través de las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE secuencialmente con 50 μL de metanol, 3x, y luego 50 μL de agua ultrapura, 3x, y finalmente 50 μL de 1% de TFA en 80% (ambos v/v) ACN, 3x.
      NOTA: Las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE se pueden preparar con horas de anticipación, pero deben almacenarse hidratadas a temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Vuelva a suspender las mezclas de péptidos secos designadas para el enriquecimiento de N-glicopéptidos en 50 μL de TFA al 1% en ACN al 80% (ambos v/v) y mezcle bien.
      NOTA: Si los péptidos son difíciles de redisolver en el disolvente de carga HILIC, los péptidos pueden redisolverse primero en TFA al 10% (v/v) y luego diluirse rápidamente en ACN para alcanzar las concentraciones del disolvente de carga HILIC. Evite calentar la muestra mientras se encuentra en una alta concentración de TFA para evitar inducir hidrólisis.
    4. Coloque las microcolumnas acondicionadas ZIC-HILIC-C8-SPE en tubos nuevos de 1,5 mL junto con adaptadores de microcentrífuga. Aplique las mezclas de péptidos resuspendidos a las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE y centrifuga a 2.000 x g durante 60 s. Es posible que se requieran varias rondas de carga para volúmenes de muestra superiores a 50 μL.
    5. Recoja la(s) fracción(es) de flujo y vuelva a aplicar la(s) fracción(es) a la misma microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE. Repita la reaplicación 2 veces y mantenga los tubos de flujo.
    6. Lave las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE 2 veces con 50 μL de TFA al 1% en ACN al 80% (ambos v/v), centrifugue y combine este flujo con el flujo del paso 3.3.4.
      NOTA: La fracción de flujo combinada generalmente contiene ~ 90% del material peptídico total, formando efectivamente la fracción peptídica no modificada que, por lo tanto, se puede usar para análisis posteriores por separado (en lugar de llevar a cabo un experimento de tipo proteómico por separado).
    7. Transfiera las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE a los nuevos tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mL. Eluir los N-glicopéptidos retenidos secuencialmente con 50 μL de AGT al 0,1% (v/v), seguido de 50 μL de bicarbonato amónico de 25 mM y luego 50 μL de ACN al 50% (v/v). Girar a 2.000 x g durante 60 s después de cada paso.
      NOTA: El eluido generalmente contiene ~ 10% del material peptídico total, la mayoría de los cuales deben ser N-glicopéptidos si se logra una alta eficiencia de enriquecimiento. Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    8. Recoja, combine y seque los N-glicopéptidos enriquecidos y (si es necesario) el flujo de péptidos no modificados a través de fracciones en un sistema concentrador de vacío.
  4. LC-MS/MS de fase reversa de N-glicopéptidos intactos
    1. Prepare los disolventes LC como se describe a continuación.
      1. Disolvente A: Preparar 1 L de ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua ultrapura. Sonicar durante 15 min para desgasificar el disolvente. El disolvente A puede almacenarse durante un mes a 20-25 °C.
      2. Disolvente B: Preparar 1 L de ácido fórmico al 0,1% en ACN al 99,9% (ambos v/v). Sonicar durante 15 min para desgasificar. El disolvente B puede almacenarse durante un mes a 20-25 °C.
    2. Vuelva a suspender las fracciones peptídicas secas en ácido fórmico al 0,1% (v/v) hasta una concentración de aproximadamente 0,2-0,5 μg de péptido/μL y mezcle bien. Gire las muestras a 14.000 x g durante 5 minutos, luego transfiera con cuidado el sobrenadante a los viales de muestra MS, dejando aproximadamente 0,5 μL para evitar transferir partículas y desechos no deseados.
    3. Para cada muestra, inyecte ~0,5-1 μg de péptido total en una columna trampa C18-LC y separe los péptidos en una columna analítica C18-LC a un caudal constante de 250 nL/min utilizando un sistema UPHLC conectado al espectrómetro de masas con un gradiente de 2%-30% de solvente B durante 100 min, 30%-50% B durante 18 min, 50%-95% B durante 1 min, y 9 min al 95% (todo v/v) B en solvente A (o una configuración apropiada).
    4. Detecte los péptidos con un espectrómetro de masas de alta resolución acoplado al sistema nanoLC equipado con una fuente de iones nano-electrospray y que funciona en modo de polaridad de iones positivos.
    5. Para MS1, utilice un rango de escaneo de adquisición de m/z 350-1.800, alta resolución a 60.000-120.000 FWHM a m/z 200 y un voltaje de fuente de ~2,5 kV. Ajuste el AGC a 3 x 106 iones con un tiempo de acumulación máximo de 50 ms (o cualquier otra configuración adecuada).
    6. Para MS/MS, seleccione los 20 iones precursores más abundantes de cada escaneo completo de MS1 para la fragmentación utilizando el modo DDA empleando HCD-MS/MS con un NCE fijo del 35% o sceHCD con NCE del 25%, 35% y 45%. Es importante destacar que fije el valor m/z más bajo en 110 (por ejemplo, rango de escaneo m/z 110 - 1.800) para observar todos los iones de oxonio de baja masa en cada espectro de fragmento.
    7. Seleccione precursores que lleven más de 2 cargas (Z ≥ 2) para la fragmentación. Adquiera espectros (sce)HCD-MS/MS a una resolución de 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC de 1 x 105 iones y un tiempo de acumulación de 90 ms utilizando una ventana de aislamiento de precursores de ± 1,0 Th. Permitir la exclusión dinámica de 30 s después del aislamiento y la fragmentación únicos de un ion precursor dado.
      NOTA: Si se dispone de ETD, considere también la posibilidad de adquirir EThcD-MS/MS de muestras de N-glicopéptidos intactas utilizando el disparo iónico dependiente del producto. Lleve a cabo este paso cuando los iones de oxonio glicano de diagnóstico (por ejemplo, m/z 138.0545, 204.0867 y 366.1396) se encuentren entre los 20 iones de fragmentos principales dentro de cada espectro HCD-MS/MS39. Detecte los fragmentos EThcD-MS/MS con una resolución de 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC de 4 x 105 iones, un tiempo de inyección de 250 ms, un NCE HCD del 15% y un ancho de aislamiento de precursores de 1,6 Th.
  5. Análisis de datos de glicoproteómica LC-MS/MS
    1. Confirmar el enriquecimiento de los datos brutos de LC-MS/MS con N-glicopéptidos comprobando que la mayoría de los espectros HCD-MS/MS contienen iones de glicano oxonio (por ejemplo, m/z 138.0545, 204.0867 y 366.1396) y (para las estrategias de etiquetado) presentan una separación de referencia de los iones reporteros TMT de baja masa, una alta eficiencia de fragmentación en los espectros MS/MS y un ancho de pico LC estrecho, y una alta precisión MS, resolución y relación señal-ruido.
    2. Utilizando un motor de búsqueda (hay varios disponibles; ver más abajo), busque los datos de MS/MS de N-glicopéptidos intactos en una base de datos adecuada de proteínas/péptidos dirigida a la muestra que se está investigando (por ejemplo, obtenida de un experimento de de-N-glicoproteómica) o en todas las proteínas humanas UniProtKB revisadas. Adapte la búsqueda contra la N-glicosilación del péptido mediante la búsqueda de péptidos con Asn localizado en secuencias. Es importante destacar que seleccione una base de datos de N-glicanos informada por la glucómica, es decir, glicanos identificados a partir de los datos de la glucómica en el paso 2, para restringir el espacio de búsqueda a los glicanos que se sabe que existen en la(s) muestra(s).
      NOTA: Se pueden considerar búsquedas paralelas utilizando una amplia base de datos de N-glicanos predefinida para descartar la existencia de composiciones adicionales de N-glicanos en los datos.
    3. Adapte las variables de búsqueda restantes de acuerdo con la muestra que se está estudiando, los procedimientos específicos de manejo de muestras realizados y la configuración de MS empleada y la instrumentación utilizada. La configuración de búsqueda común para la búsqueda de datos de N-glicoproteómica incluye:
      Tolerancia de masa de precursores y productos: 10 ppm y 20 ppm
      Especificidad de la proteasa: Totalmente específica y/o semiespecífica (N-ragged)
      Escotes perdidos permitidos: 2
      Modificaciones corregidas: Carbamidometilación de Cys (+57.021 Da)
      Modificaciones variables: Oxidación met (+15.994 Da) (común 1)
      Modificaciones de variables permitidas por péptido: 1 o 2
      Modificaciones de glicanos: base de datos de glicanos informada por glicomicas (raro 1)
      Base de datos de señuelos y contaminantes de proteínas: Habilitado
    4. Filtre todas las búsquedas al <1% de tasa de falsos descubrimientos (FDR) a nivel de proteínas y péptidos. Considere solo los N-glicopéptidos identificados con alta confianza (p. ej., puntuaciones PEP 2D < 0.001) y realice la anotación/curación manual de la salida filtrada para reducir aún más la tasa de identificación incorrecta de N-glicopéptidos como se discutió 36,40,41.
      NOTA: Los glicopéptidos con N-glicanos y glicopéctidos sialilados y multifucosilados que llevan otras modificaciones variables además de los glicanos (es decir, oxidación Met y desamidación Asn/Gln) son particularmente propensos a interpretaciones erróneas por parte de los motores de búsqueda41. Se debe prestar especial atención a la validación de dichos candidatos antes de presentar un informe.

Resultados

En esta sección se proporcionan resultados representativos del método de glicoproteómica guiado por glucómica aplicado a un portaobjetos de tejido FFPE de un paciente con CCR en estadio II.

Para lograr suficiente material de partida proteico para el protocolo, se combinaron extractos de proteínas de dos portaobjetos (pilas z) del mismo bloque de tejido FFPE siguiendo un protocolo publicado y se aplicó un enfoque de etiquetado TMT para aumentar la sensibi...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
En este documento de protocolo, hemos descrito paso a paso el método de glicoproteómica guiado por glucómicos, que proporciona una visión completa de la heterogeneidad y la dinámica del glicoproteoma en el complejo TME.

Un paso crítico en el protocolo es garantizar una proteólisis completa sin digerir en exceso la mezcla de proteínas. Las escisiones inespecíficas de las proteínas aumentan inherentem...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

El THC cuenta con el apoyo de una beca del Programa Internacional de Formación en Investigación financiada por el gobierno australiano. NB cuenta con el apoyo de las Becas Internacionales de Excelencia en Investigación de la Universidad de Macquarie financiadas por la Universidad de Macquarie. AC cuenta con el apoyo de una beca del Programa de Formación en Investigación financiada por el Gobierno de Australia. RK contó con el apoyo del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur (ECF181259). La MTA es la beneficiaria de una beca Future Fellowship (FT210100455) del Consejo Australiano de Investigación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium acetate Sigma AldrichA1542Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%Sigma AldrichA6141Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS gradeSigma Aldrich34851Alternatives available
Bovine fetuinSigma AldrichF3004Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatives available
EthanolSigma AldrichE7023Alternatives available
Formic acid, LC-MS gradeSigma Aldrich00940Alternatives available
Glacial acetic acidSigma AldrichA6283Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatives available
MethanolSigma AldrichM1775Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin PromegaV5113Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS gradeSigma AldrichT7408Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS gradeSigma AldrichT6508Alternatives available
Tools/Materials
C18 disksEmpore66883-U
C8 disksEmpore66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMilliporeIPVH20200Pore size: 0.45 μm 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069Alternatives available
Microcentrifuge adapters The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resinThermo1133903Particle size 30 μm
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind tubes 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatives available
Single hole puncherSwingline74005
SpeedVac concentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resinSupelco57088Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatives available
Temperature-controlled incubatorThermolineE7.30Alternatives available
Ultrasonic bathUnisonicsFXPAlternatives available
ZIC-HILIC resinMerck150455Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns MilliporeZTC18S096Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system AgilentAlternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resinDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System ThermoAlternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column ThermoDiscontinuedParticle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U). 
LCMS-grade acetonitrileLiChrosolv100029Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics) ThermoAlternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)ThermoOther high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mLThermoTHC11093563Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching capsThermoTHC09150869Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 or higherCommercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 or higherCommercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoModExpasyOpen access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeatVAST Scientificv2.1Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 or higherOpen access software for relative quantitation of glycans
XcaliburThermov2.2 or higherFor browsing raw LC-MS/MS data

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