Гликопротеомика под контролем гликомики способствует комплексному профилированию гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях

Резюме

В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под руководством гликомики, интегрированная омиксная технология, которая предлагает всестороннее понимание гетерогенного гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях, необходимое для лучшего понимания гликобиологии рака.

Аннотация

Гликозилирование является распространенной и структурно разнообразной модификацией белка, которая влияет на широкий спектр опухолевых процессов. Гликомика и гликопротеомика, основанные на масс-спектрометрии, стали мощными подходами к анализу высвобожденных гликанов и интактных гликопептидов соответственно, предлагая более глубокое понимание гетерогенного гликопротеома в микроокружении опухоли (ТМЭ). В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под контролем гликомики, интегрированная омиксная технология, в которой, во-первых, используется гликомика на основе пористого графитизированного углерода, LC-MS/MS для выяснения гликановых структур и их количественного распределения в гликоме исследуемых опухолевых тканей, клеточных популяций или жидкостей организма. Это позволяет провести сравнительный гликомический анализ для выявления измененных гликозилирования в группах пациентов, стадиях заболевания или состояниях и, что важно, служит для улучшения последующего гликопротеомического анализа того же образца (образцов) путем создания библиотеки известных гликановых структур, тем самым сокращая время поиска данных и частоту ошибочной идентификации гликопротеинов. Сосредоточив внимание на профилировании N-гликопротеомики, в этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов для метода гликопротеомики под контролем гликомики, а также обсуждаются ключевые аспекты сбора и анализа данных. Метод гликопротеомики под контролем гликомики предоставляет количественную информацию о гликопротеинах, присутствующих в ТМЭ, и их сайтах гликозилирования, занятости сайтов и сайт-специфических гликановых структурах. Репрезентативные результаты представлены на основе фиксированных формалином парафин-интегральных тканей пациентов с колоректальным раком, демонстрируя, что метод чувствителен и совместим с тканевыми срезами, обычно встречающимися в биобанках. Таким образом, гликопротеомика, управляемая гликомикой, предлагает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеома в сложных ТМЭ, генерируя надежные биохимические данные, необходимые для лучшего понимания гликобиологии рака.

Введение

Гликозилирование белков является распространенным и сложным типом ко- и посттрансляционной модификации белков, продуцируемых видами в филогенетическом древе жизни ^1,2,3. Известно, что связанные с белками гликаны влияют на широкий спектр биологических процессов, важных для здоровья человека, включая посредничество и регуляцию клеточных взаимодействий и коммуникационных событий ^4,5. Считалось, что аберрантное гликозилирование белка является причиной злокачественной трансформации, прогре....

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований человека (медицинские науки) в Университете Маккуори, Сидней, Австралия (протокол 5201800073).

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод гликопротеомики под руководством гликомики может быть применен к разнообразному набору биологических образцов от низкой до экстремальной сложности гликопротеинов. Для подходов к гликопротеомике без меток (при которых объединение образцов не проводится) требуется примерно 100-200 мкг общего белка из сложных смесей в качестве исходного материала для обеспечения высокого охвата гликопротеома после обогащения гликопептидами, которые могут сос....

Результаты

В этом разделе представлены репрезентативные результаты метода гликопротеомики под контролем гликомики, примененного к тканевому стеклу FFPE у пациента с КРР на стадии II.

Для получения достаточного количества исходного материала белка для протокола бе.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
В этом протокольном документе мы шаг за шагом описали метод гликопротеомики, управляемый гликомикой, который обеспечивает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеомии в сложной ТМЭ.

Ва.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	A1542	Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%	Sigma Aldrich	A6141	Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Sigma Aldrich	34851	Alternatives available
Bovine fetuin	Sigma Aldrich	F3004	Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632	Alternatives available
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Alternatives available
Formic acid, LC-MS grade	Sigma Aldrich	00940	Alternatives available
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	A6283	Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149	Alternatives available
Methanol	Sigma Aldrich	M1775	Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)	Promega	V4831	Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)	Sigma Aldrich	PVP40	Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	484016	Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin	Promega	V5113	Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma Aldrich	213462	Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T7408	Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T6508	Alternatives available
Tools/Materials
C18 disks	Empore	66883-U
C8 disks	Empore	66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate	Corning	3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH20200	Pore size: 0.45 μm
Microcentrifuge	Eppendorf	5452000069	Alternatives available
Microcentrifuge adapters	The Nest Group, Inc., MA	SS18V	MiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resin	Thermo	1133903	Particle size 30 μm
Parafilm	Parafilm M	PM996
Protein LoBind tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030120094
Shaker	Eppendorf	5382000066	Alternatives available
Single hole puncher	Swingline	74005
SpeedVac concentrator	Martin Christ	RVC 2-25 CDplus	Alternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resin	Supelco	57088	Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mL	Sigma Aldrich	Z116866	Alternatives available
Temperature-controlled incubator	Thermoline	E7.30	Alternatives available
Ultrasonic bath	Unisonics	FXP	Alternatives available
ZIC-HILIC resin	Merck	150455	Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns	Millipore	ZTC18S096	Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system	Agilent		Alternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r13.aq.s2570	Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System	Thermo		Alternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column	Thermo	Discontinued	Particle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U).
LCMS-grade acetonitrile	LiChrosolv	100029	Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics)	Thermo		Alternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)	Thermo		Other high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mL	Thermo	THC11093563	Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching caps	Thermo	THC09150869	Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r15.aq.s0202	Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available.
Software
Byonic	Protein Metrics Inc	v2.6.46 or higher	Commercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
Byos	Protein Metrics Inc	v3.9-7 or higher	Commercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoMod	Expasy		Open access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBench	EUROCarbDB	v2.1	Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeat	VAST Scientific	v2.1	Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
Skyline	Brendan X. MacLean	v21.2 or higher	Open access software for relative quantitation of glycans
Xcalibur	Thermo	v2.2 or higher	For browsing raw LC-MS/MS data