JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под руководством гликомики, интегрированная омиксная технология, которая предлагает всестороннее понимание гетерогенного гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях, необходимое для лучшего понимания гликобиологии рака.

Аннотация

Гликозилирование является распространенной и структурно разнообразной модификацией белка, которая влияет на широкий спектр опухолевых процессов. Гликомика и гликопротеомика, основанные на масс-спектрометрии, стали мощными подходами к анализу высвобожденных гликанов и интактных гликопептидов соответственно, предлагая более глубокое понимание гетерогенного гликопротеома в микроокружении опухоли (ТМЭ). В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под контролем гликомики, интегрированная омиксная технология, в которой, во-первых, используется гликомика на основе пористого графитизированного углерода, LC-MS/MS для выяснения гликановых структур и их количественного распределения в гликоме исследуемых опухолевых тканей, клеточных популяций или жидкостей организма. Это позволяет провести сравнительный гликомический анализ для выявления измененных гликозилирования в группах пациентов, стадиях заболевания или состояниях и, что важно, служит для улучшения последующего гликопротеомического анализа того же образца (образцов) путем создания библиотеки известных гликановых структур, тем самым сокращая время поиска данных и частоту ошибочной идентификации гликопротеинов. Сосредоточив внимание на профилировании N-гликопротеомики, в этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов для метода гликопротеомики под контролем гликомики, а также обсуждаются ключевые аспекты сбора и анализа данных. Метод гликопротеомики под контролем гликомики предоставляет количественную информацию о гликопротеинах, присутствующих в ТМЭ, и их сайтах гликозилирования, занятости сайтов и сайт-специфических гликановых структурах. Репрезентативные результаты представлены на основе фиксированных формалином парафин-интегральных тканей пациентов с колоректальным раком, демонстрируя, что метод чувствителен и совместим с тканевыми срезами, обычно встречающимися в биобанках. Таким образом, гликопротеомика, управляемая гликомикой, предлагает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеома в сложных ТМЭ, генерируя надежные биохимические данные, необходимые для лучшего понимания гликобиологии рака.

Введение

Гликозилирование белков является распространенным и сложным типом ко- и посттрансляционной модификации белков, продуцируемых видами в филогенетическом древе жизни 1,2,3. Известно, что связанные с белками гликаны влияют на широкий спектр биологических процессов, важных для здоровья человека, включая посредничество и регуляцию клеточных взаимодействий и коммуникационных событий 4,5. Считалось, что аберрантное гликозилирование белка является причиной злокачественной трансформации, прогрессирования опухоли и ее распространения 6,7,8. Это вовлекает гликаны в ключевые опухолевые процессы в опухолевом микроокружении (ТМЭ) и предлагает значительный и в значительной степени неиспользованный потенциал для открытия биомаркеров на основе гликанов и их терапевтического применения. Таким образом, гликобиология привлекает все большее внимание в исследованиях рака и в науках о жизни9.

Опираясь на ключевые достижения в области гликоаналитики и информатики за последнее десятилетие 10,11,12,13,14,15,16,17, гликомика и гликопротеомика, управляемые жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), были созданы в качестве мощных инструментов для общесистемного профилирования высвобожденных гликанов и интактных гликопептидов из сложных смесей Гликопротеины, извлеченные непосредственно из их биологических образцов, таких как различные типы образцов раковых больных (например, опухолевые ткани, клеточные популяции, биологические жидкости)3,13,18,19,20.

Гликомика дает информацию о структуре и количестве гликанового репертуара (гликома), который динамически вырабатывается клетками, тканями и даже целыми организмами. С другой стороны, гликопротеомика предоставляет количественную информацию о переносчиках белка и их месте (сайтах) гликозилирования, коэффициентах заполнения сайта (макрогетерогенность), сайт-специфичных гликановых композициях и их структуре распределения по сайту (микрогетерогенность) с ограниченной структурной информацией гликана (часто ограниченной гликановым составом)15,16,21. Следовательно, гликомика и гликопротеомика являются взаимодополняющими подходами к изучению биохимических деталей гликопротеома22.

В зависимости от интересующего гликоаналита (например, N-/O-/C-связанный, гликан/гликопептид/гликопротеин, меченый/немеченый) было разработано множество методологических разработок и аналитических стратегий для гликомики и гликопротеомики, которые были применены в различных лабораториях в зависимости от используемого гликоаналита (например, N-/O-/C-сцепленного, гликан/гликопептид/гликопротеин, меченый/немеченый), характера образца (например, клетки, ткани, жидкости организма), количества (уровень белка в нанограммах/микрограммах/миллиграммах) и имеющегося аналитического прибора. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Несмотря на признанные преимущества их параллельного использования, гликомика и гликопротеомика обычно не применяются вместе, а скорее как самостоятельные подходы в гликобиологических исследованиях и исследованиях рака из-за их высокой потребности в аналитических знаниях и специализированных инструментах.

Осознавая этот технологический пробел, более десяти лет назад мы внедрили метод гликопротеомики с помощью гликомики, который способен интегрировать данные гликомики и гликопротеомики, полученные из сложных биологическихобразцов. Короче говоря, технология гликопротеомики с помощью гликомики (или под руководством гликомики, как в данном протоколе) профилирует N- и/или O-гликаны с помощью установленного метода34,35 LC-MS/MS с пористым графитированным углеродом (PGC), КОТОРЫЕ ЗАТЕМ используются для анализа данных об интактных N- и/или O-гликопептидах, полученных из одного и того же образца (образцов) путем определения границ пространства поиска гликанов36. PGC-LC-MS/MS является особенно мощным гликомическим методом, поскольку он обеспечивает количественное понимание гликома с высокой чувствительностью и структурным разрешением, предоставляя информацию о топологии (моносахаридная последовательность и структура ветвления) и гликозидных связях гликанов даже в сложных смесях 35,37,38 . Рабочий процесс гликопротеомики включает в себя генерацию пептидов, необязательное мечение пептидов, мультиплексирование и префракционирование, а также обогащение перед анализом LC-MS/MS в обращенной фазе, который в идеале использует различные методы фрагментации, включая ступенчатую энергию столкновения/столкновительную диссоциацию с более высокой энергией (sceHCD, для N-гликопептидов) и перенос электронов/столкновительную диссоциацию с более высокой энергией (EThcD, для O-гликопептидов) для идентификации аналита. Для анализа N-гликопротеома параллельная де-N-гликопротеомика может направлять анализ данных по интактным N-гликопептидам путем определения пространства поиска белка/пептида и предоставления более подробной информации о занятых сайтах N-гликозилирования и скорости их заполнения, в то время как параллельный анализ немодифицированных пептидов выявляет любые изменения уровня белка между исследуемыми условиями.

В этом документе представлен подробный и простой для понимания пошаговый протокол для метода гликопротеомики под руководством гликомики (см. Рисунок 1 для обзора рабочего процесса). Протокол содержит экспериментальные детали этапов подготовки образцов и экспериментов по гликомике и гликопротеомике на основе LC-MS/MS, а также представляет репрезентативные результаты, демонстрирующие применение метода к фиксированным формалином парафин-инъемированным (FFPE) тканевым срезам опухолей, резецированных у пациентов с колоректальным раком (КРР), что позволяет получить представление о гликобиологии TME в ценном типе образца, который архивируется в биобанках рака по всему миру. Также кратко обсуждаются анализ и интеграция данных гликомики и гликопротеомики.

figure-introduction-7415
Рисунок 1: Обзор метода гликопротеомики, управляемого гликомикой. В обзоре показаны подробные экспериментальные этапы в рабочих процессах гликомики (слева) и гликопротеомики (справа), а также обзор полученной информации (выделен жирным шрифтом) и то, как эти два подхода интегрируются за счет улучшенного анализа и интерпретации данных. Вставка: Самодельные микроколонки SPE, используемые для (i) гликомики и (ii-iii) гликопротеомики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований человека (медицинские науки) в Университете Маккуори, Сидней, Австралия (протокол 5201800073).

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод гликопротеомики под руководством гликомики может быть применен к разнообразному набору биологических образцов от низкой до экстремальной сложности гликопротеинов. Для подходов к гликопротеомике без меток (при которых объединение образцов не проводится) требуется примерно 100-200 мкг общего белка из сложных смесей в качестве исходного материала для обеспечения высокого охвата гликопротеома после обогащения гликопептидами, которые могут составлять только 1%-10% популяции пептидов. Из-за нехватки места первоначальная экстракция белка из клеток или тканей не проводится, и читатели отсылаются к другим ресурсам15. Гликомика консервативно потребляет ~10-20 мкг белка на анализ для глубокого профилирования гликома, оставляя большую часть белкового экстракта для гликопротеомики. Если не указано иное, то были упомянуты конечные концентрации, а химические вещества должны быть растворены в воде сверхвысокого качества для получения водных растворов в протоколе ниже.

1. Белковая подготовка

  1. Определите концентрацию белка в экстрактах с помощью установленного метода (например, с помощью бицинхониновой кислоты или белкового анализа по Брэдфорду). Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мкг/л в 50 мМ TEAB (pH 8,5).
  2. Уменьшите дисульфидные связи путем инкубации образцов с 10 мМ DTT в течение 45 мин при 56 °C. Алкилатируют свободные тиоловые группы путем последующей инкубации образцов с 40 мМ IAA в темноте в течение 30 мин при 20-25 °С. Погасите реакцию алкилирования избытком DTT (~40 мМ).
  3. Разделите каждый образец белка. Допускайте примерно 10-20 г белка для гликомики и 100-200 г белка для рабочего процесса гликопротеомики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к представляющему интерес образцу (образцам) белка включите известный модельный гликопротеин (например, плод крупного рогатого скота) или белковую смесь (например, лизат клеточной линии, плазму) для оценки эффективности и воспроизводимости процедур и для мониторинга эффективности ЖХ-МС/МС.

2. Рабочий процесс N-гликомики

  1. Иммобилизация белков на мембране из ПВДФ
    1. С помощью дырокола с одним отверстием разрежьте фитинг мембраны из ПВДФ с количеством образцов белка, которые необходимо обнаружить.
    2. Смочите иссеченные мембраны этанолом или метанолом, затем переложите мембраны на 96-луночный планшет с плоским дном.
    3. Когда мембраны почти высохнут, поместите образцы белка в максимальный объем 2,5 мкл на место, чтобы свести к минимуму площадь поверхности осажденного образца белка. При необходимости повторите пробы так, чтобы общее количество иммобилизованного белка на пятне составляло ~10-20 мкг. Для этого дайте точечному воздуху высохнуть, прежде чем повторять процедуру пятнистости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пятнистости может потребоваться повторное увлажнение мембраны этанолом или метанолом, чтобы предотвратить полное высыхание мембран.
    4. Высушите мембраны на воздухе при температуре 20-25 °C в течение не менее 3 часов, желательно в течение ночи. Избегайте загрязнения мембран во время сушки.
      Примечание: В качестве дополнительного этапа контроля качества белки, обнаруженные на мембранах, могут быть визуализированы путем окрашивания раствором Direct Blue 71, как описано ранее34.
  2. Высвобождение N-гликанов, связанных с белками
    1. Добавьте 100 мкл 1% (w/v) PVP40 в метаноле в каждую лунку, содержащую пятнистые мембраны. Убедитесь, что сторона мембраны, на которой был обнаружен образец белка, обращена вверх на протяжении всей подготовки образца.
    2. Встряхните пластину в растворе PVP40 в течение 5 минут при температуре 20-25 °C, затем выбросьте раствор PVP40.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор PVP40 блокирует мембраны и лунки PVDF, чтобы предотвратить неспецифическое связывание PNGase F (и любых экзогликозидаз, которые могут быть применены для получения информации, специфичной для сцепления в параллельных экспериментах; см. обсуждение ниже) на последующих этапах.
    3. Промойте каждую лунку, содержащую заблокированные белковые пятна, 100 μл сверхчистой воды и встряхивайте пластину в течение 5 минут. Повторите этот шаг 3 раза. Следите за тем, чтобы вода полностью сливалась после каждой стирки.
    4. Добавьте 15 μL раствора PNGase F (0,5 Ед/мкл, разведенный в сверхчистой воде из 10 Ед/мкл исходного раствора) в каждую лунку, предполагая, что было отложено 15 мкг белка на образец.
    5. Добавьте воду в окружающие пустые лунки, чтобы предотвратить обезвоживание образца на последующих этапах инкубации, и используйте прозрачную пленку, чтобы тщательно запечатать пластину. Выдерживайте планшет не менее 8 ч при 37 °C.
    6. Обрабатывайте пластину ультразвуком в течение 5 минут, чтобы любые испарившиеся капли со стороны лунок собрались на дне пластины.
    7. Осторожно перенесите высвобожденные образцы N-гликана в отдельные микроцентрифужные пробирки (1,5 мл). Промойте лунки для образца 2 раза 20 мкл сверхчистой воды, дозируйте и отасуньте несколько раз. Объедините все оставшиеся образцы из каждой лунки в микроцентрифужные пробирки, содержащие образцы N-гликанов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования пробирок с низкой связывающей способностью для подготовки образцов N-гликомики, так как гидрофильные гликаны могут необратимо связываться с пробирками с покрытием.
    8. Добавьте 10 мкл 100 мМ ацетата аммония pH 5,0 и инкубируйте образцы в течение 1 ч при 20-25 °C.
      Примечание: На этой стадии гидроксилируют аминированные остатки N-ацетилглюкозамина на восстановительном конце высвобожденных N-гликанов, что позволяет обеспечить исчерпывающее снижение на следующей стадии. Отрегулируйте 100 мМ ацетата аммония до pH 5,0, так как высокая скорость превращения гликозиламина в гидроксил в восстановительном конце отделенных N-гликанов зависит от слабой кислотности раствора.
    9. Высушите образцы N-гликана в вакуумной концентраторе.
  3. Снижение высвобожденных N-гликанов
    1. Добавьте 20 мкл свежеприготовленного 1 М NaBH4 в 50 мМ KOH к высушенным образцам N-гликана и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NaBH4 должен быть свежеприготовленным в KOH в день использования.
    2. Плотно закройте крышки каждой пробирки и инкубируйте образцы в течение 3 ч при температуре 50 °C.
      N-гликаны подвергаются восстановлению, в результате которого α- и β-аномеры восстановительного конца превращаются в одну форму альдитола, что приводит к одному хроматографическому пику в анализе PGC-LC-MS/MS.
    3. После инкубации пробирки с образцами вращают в микроцентрифуге, чтобы довести жидкость до дна пробирок.
    4. Добавьте 100 μL сверхчистой воды в каждый образец. Добавьте 2 мкл ледяной уксусной кислоты для нейтрализации щелочных образцов N-гликанов. Вращайте пробирки с образцами в микроцентрифуге, чтобы доставить образцы на дно пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ледяная уксусная кислота нейтрализует щелочные образцы, что приводит к образованию газообразного водорода (Н2) и последующему шипению во время реакции.
  4. Обессоливание N-гликанов с помощью PGC-C18-SPE
    1. Подготовьте самодельные микроколонки PGC-C18-SPE, как описано ниже.
      1. С помощью подходящего шприца заткните и переложите диски C18 на подходящие наконечники для пипеток (10 мкл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь также можно использовать коммерческие микроколонны C18-SPE.
      2. Пипетка 10 мкл суспензии смолы PGC, взвешенной в 50% (v/v) метаноле в микроколонки C18-SPE. Поместите микроколонки в пробирки объемом 2 мл, оснащенные адаптерами для микроцентрифуг. Вращайте трубки, чтобы получить микроколонны PGC-C18-SPE с высотой колонны ~0,5 см (см. рис. 1i). Подготовьте одну микроколонку PGC-C18-SPE для каждого образца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Использование адаптеров гарантирует, что микроколонны будут подвешены в центре трубы.
      3. Для последующих этапов промывки и загрузки образцов установите настольную центрифугу на 6 000 об/мин (~ 2 000 x g) и вращайте в течение 60 с, чтобы облегчить прохождение подвижных фаз через микроколонки PGC-C18-SPE. Промойте и кондиционируйте каждую микроколонку PGC-C18-SPE последовательно 50 μL 0,1% (v/v) TFA в ACN три раза, а затем 50 μL 0,1% (v/v) TFA три раза.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Микроколонки PGC-SPE можно подготовить за несколько часов до использования, но перед использованием их необходимо хранить гидратированными при комнатной температуре.
    2. Нанесите образцы N-гликана на микроколонки PGC-C18-SPE в объеме загрузки до 40 мкл и вращайте со скоростью 6 000 об/мин (~ 2 000 x g) в течение 60 с после каждого добавления. Повторяйте этап загрузки до тех пор, пока весь образец N-гликана не будет нанесен на микроколонку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя проточные фракции не должны содержать гликаны, мы рекомендуем сохранять эти фракции до тех пор, пока данные гликомики не будут успешно получены в случае неполного удержания на микроколонках PGC-C18-SPE.
    3. Промойте микроколонки PGC-C18-SPE 20 μл сверхчистой воды. Перенесите микроколонки PGC-C18-SPE в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для подготовки к элюированию N-гликаном.
    4. Разбавьте N-гликаны, добавив 40 мкл 0,1% TFA в 50% (оба v/v) ACN в каждую микроколонку PGC-C18-SPE, затем открутите. Повторите эту процедуру и совместите элюат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно следить за микроколоннами после каждого вращения, чтобы убедиться, что раствор полностью пропущен, так как это будет способствовать эффективному элюированию.
    5. Высушите обессоленные N-гликаны в вакуумной обогатительной системе.
  5. Сбор данных PGC-LC-MS/MS
    1. Приготовьте растворители LC, как описано ниже.
      1. Растворитель А: Приготовьте 100 мл 100 мл стокового раствора бикарбоната аммония (NH4HCO3) в сверхчистой воде. Отфильтруйте стоковый раствор через нейлоновый фильтрующий диск длиной 0,2 мкм с помощью вакуумной фильтрационной установки для удаления твердых частиц. Затем приготовьте 1 л 10 мл раствора NH4HCO3 (растворитель А), разбавив 100 мл 100 мл стокового раствора NH4HCO3 в 900 мл сверхчистой воды. Ультразвуком растворитель А в течение 15 мин дегазирует раствор. Растворитель А может храниться в течение 1 недели при температуре 20-25 °С, в то время как 100 мМ стоковый раствор NH4HCO3 может храниться в течение 1 месяца при 4 °С.
      2. Растворитель В: Приготовьте 1 л 10 мл 10 мМ NH4HCO3 в 70% (v/v) ACN в сверхчистой воде (растворитель B) путем добавления 100 мл 100 мл стокового раствора NH4HCO3 (см. предыдущий шаг 2.5.1.2) к 700 мл ACN и разбавьте до общего объема 1 л сверхчистой водой. Ультразвуковой растворитель В течение 15 мин для дегазации. Растворитель B может храниться в течение 2 недель при температуре 20-25 °C.
    2. Суспендируйте обессоленные N-гликаны в 10 мкл сверхчистой воды и тщательно перемешайте. Вращайте образцы при давлении 14 000 x g в течение 5 минут, затем осторожно перенесите надосадочную жидкость во флаконы с образцами МС, оставляя около 0,5 мкл, чтобы избежать переноса видимых или невидимых частиц и мусора, которые могут повредить систему ЖХ-МС/МС.
    3. Вводите и отделяйте N-гликаны в капиллярной колонке PGC-LC, нагретой до 50 °C, с использованием 60-минутного линейного (или иным образом) градиента 0%-70% (v/v) растворителя B в растворителе A в системе ВЭЖХ. Убедитесь, что система ВЭЖХ подключена к масс-спектрометру и работает с постоянным расходом 20 мкл/мин (отрегулируйте расход в соответствии с геометрией колонки PGC-LC).
    4. Детектирование разделенных N-гликанов осуществляется с помощью квадрупольного масс-спектрометра с линейной ионной ловушкой (или другой подходящей системы МС с низким или высоким разрешением), установленной с источником ионов с электрораспылением и работающей в режиме отрицательной полярности ионов.
    5. Установите диапазон сканирования сбора данных MS1 на m/z 150-2,000 с максимальной шириной сканирования зума m/z 0,25 и полной шириной полумаксимума (FWHM) на m/z 200. Установите напряжение источника на 3,2 кВ. Для сканирования MS1 установите автоматическую регулировку усиления (AGC) на 5 x 104 ионов с максимальным временем накопления 50 мс (или другими подходящими настройками).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкий начальный m/z включает в себя обнаружение моно- и дисахаридов, которые часто вносят свой вклад в N- и O-гликом.
    6. Для MS/MS установите разрешение m/z 0,25 FWHM при m/z 200, AGC на 2 x 104 иона, а максимальное время накопления на 300 мс. Включите сбор данных, зависящий от данных (DDA), и выберите пять наиболее распространенных предшественников в каждом полном сканировании MS1 для фрагментации с использованием резонансной активации (ионной ловушки) и диссоциации, вызванной столкновением (CID) с нормированной энергией столкновения (NCE) 33%. Снимите флажок динамического исключения, чтобы избежать пропуска изобарических изомеров N-гликанов с близким покрытием.
  6. Анализ данных гликомикики ЖХ-МС/МС
    1. Просматривайте сгенерированные необработанные данные ЖХ-МС/МС с помощью соответствующего программного обеспечения, чтобы обеспечить высокое качество данных после подтверждения узкой пиковой ширины ЖХ, эффективного разделения изомеров N-гликанов, высокой точности МС, разрешения и соотношения сигнал/шум, а также высокой эффективности фрагментации CID-МС/МС.
    2. Вручную определите N-гликаны в образце на основе их моноизотопного предшественника, характера фрагментации CID-MS/MS, а также относительного и абсолютного времени удержания PGC-LC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: RawMeat v2.1, GlycoMod и GlycoWorkBench v2.1 могут помочь в процессе идентификации, как описано26. Известные ограничения биосинтеза и структурное родство между наблюдаемыми аналитами также могут добавить дополнительную уверенность в идентифицированных N-гликанах26. В качестве альтернативы, полуавтоматическая идентификация гликанов и спектральная аннотация могут быть выполнены с помощью коммерческого программного обеспечения.
    3. Для количественного определения относительного N-гликана сгенерируйте список переходов, содержащий моноизотопный предшественник m/z всех идентифицированных изомеров N-гликанов, и используйте коммерческое программное обеспечение для определения значений площади под кривой (AUC) на основе выделенных ионных хроматограмм (EIC) всех ионов-предшественников N-гликанов, как описано26.

3. Рабочий процесс N-гликопротеомики

  1. Переваривание белковой смеси
    1. Расщепите 100-200 мкг восстановленного и алкилированного белкового экстракта (из части 1), добавив трипсин (соотношение фермент:белок 1:50, масса) и/или другие протеазы по выбору в каждый образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от пробоподготовки гликомики, используйте, по возможности, микроцентрифужные пробирки с низкой связываемостью для этапов подготовки образцов гликопротеомики для максимального извлечения пептидов.
    2. Образцы инкубируют в течение 8-12 ч при 37 °C. Убедитесь, что pH составляет ~8,5, так как слабощелочной раствор улучшает эффективность переваривания трипсина.
      Примечание: Предпочтение отдается специфическим протеазам, которые вызывают предсказуемые паттерны расщепления и оставляют большинство N-гликопептидов с одним пайоном (сайтом гликозилирования), такими как трипсин и Lys-C. Избегайте чрезмерной инкубации образцов для уменьшения неспецифического расщепления белков трипсином или другими протеазами.
    3. Остановите сбраживание путем подкисления (чтобы избежать неспецифических расщеплений, вызванных длительным сбраживанием) путем добавления 1% (v/v) ТЖК.
  2. Пептидное обессоливание с помощью Oligo R3-C18-SPE
    1. Подготовьте самодельные микроколонны Oligo R3-C18-SPE, как описано ниже.
      1. С помощью подходящего шприца заткните и перенесите диски C18 на наконечники пипеток объемом 10 мкл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь также можно использовать коммерческие микроколонны C18-SPE.
      2. Нанесите суспензию смолы Oligo R3, взвешенной в аккуратном ACN, в микроколонны C18-SPE. Поместите микроколонки в пробирки объемом 2 мл, оснащенные адаптерами для микроцентрифуг, чтобы убедиться, что микроколонки подвешены в центре пробирки, и вращайте для создания микроколонок Oligo R3-C18-SPE с высотой колонки ~1 см (см. Рисунок 1ii). Подготовьте по одной микроколонке Oligo R3-C18-SPE для каждого образца.
    2. Для последующих этапов промывки и загрузки образцов отрегулируйте настольную центрифугу на 6 000 об/мин (~ 2 000 x g) и вращайте в течение 60 с, чтобы подвижные фазы могли проходить через микроколонки Oligo R3-C18-SPE. Вымойте и кондиционируйте каждую микроколонку Oligo R3-C18-SPE последовательно 50 μл чистого ACN, 3x, а затем 50 μL 0,1% (v/v) TFA, 3x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроколонки Oligo R3-C18-SPE могут быть заранее подготовлены и храниться гидратированными в течение нескольких часов при комнатной температуре перед использованием.
    3. Поместите кондиционированные микроколонки Oligo R3-C18-SPE в новые пробирки объемом 1,5 мл вместе с адаптерами для микроцентрифуг. Нанесите триптически расщепленные пептидные смеси на микроколонки Oligo R3-C18-SPE и вращайте при температуре 2 000 x g в течение 60 с. Для образцов объемом более 50 мкл может потребоваться многократная загрузка.
    4. Промойте микроколонки Oligo R3-C18-SPE 50 мкл 0,1% (v/v) TFA, 3x. Перенесите микроколонки Oligo R3-C18-SPE в новые пробирки объемом 1,5 мл для подготовки к элюированию обессоленных пептидов.
    5. Разбавляйте обессоленные пептиды путем внесения 50 мкл 0,1% ТЖК в 50% (оба v/v) ACN, а затем 50 мкл 0,1% TFA в 70% (оба v/v) ACN в каждую микроколонку Oligo R3-C18-SPE. Вращайтесь после каждого шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно следить за микроколоннами после каждого вращения, чтобы убедиться, что раствор полностью пропущен, так как это будет способствовать эффективному элюированию.
    6. Соберите, объедините и высушите обессоленные пептиды в системе вакуумного концентратора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении параллельной протеомики и де-N-гликопротеомики (см. Обсуждение) разделите образцы обессоленного пептида и отложите отдельные фракции перед сушкой.
  3. Обогащение N-гликопептида с помощью ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Подготовьте самодельные микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE, как описано ниже.
      1. С помощью подходящего шприца заткните и переложите диски C8 на наконечники пипеток объемом 10 мкл.
      2. Нанесите суспензию смолы ZIC-HILIC, взвешенной в метаноле, в микроколонны C8-SPE. Поместите микроколонки в пробирки объемом 2 мл, оснащенные адаптерами для микроцентрифуг, чтобы убедиться, что микроколонки подвешены в центре пробирки, и вращайте, чтобы создать микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE с высотой колонки ~1 см (см. Рисунок 1iii). Подготовьте по одной микроколонке ZIC-HILIC-C8-SPE для каждого образца.
    2. Для последующей промывки и загрузки образцов отрегулируйте настольную центрифугу на 6 000 об/мин (~2 000 x g) и вращайте в течение 60 с, чтобы подвижные фазы могли проходить через микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE. Промойте и кондиционируйте каждую микроколонку ZIC-HILIC-C8-SPE последовательно 50 μл метанола, 3x, затем 50 μL сверхчистой воды, 3x и, наконец, 50 μL 1% TFA в 80% (оба v/v) ACN, 3x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE можно готовить за несколько часов до использования, но перед использованием их необходимо хранить гидратированными при комнатной температуре.
    3. Суспендировать высушенные пептидные смеси, предназначенные для обогащения N-гликопептидами, в 50 мкл 1% ТЖК в 80% (как v/v) ACN, так и тщательно перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пептиды трудно повторно растворить в загрузочном растворителе HILIC, пептиды могут быть сначала повторно растворены в 10% (v/v) TFA, а затем быстро разбавлены в ACN для достижения концентраций загрузочного растворителя HILIC. Избегайте нагрева образца при высокой концентрации ТЖК, чтобы избежать индуцирования гидролиза.
    4. Поместите кондиционированные микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE в новые пробирки объемом 1,5 мл вместе с адаптерами для микроцентрифуг. Нанесите ресуспендированные пептидные смеси на микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE и вращайте при давлении 2 000 x g в течение 60 с. Для образцов объемом более 50 мкл может потребоваться многократная загрузка.
    5. Соберите проточную фракцию (фракции) и повторно нанесите фракцию (фракции) на ту же микроколонку ZIC-HILIC-C8-SPE. Повторите нанесение 2 раза и сохраните проточные трубки.
    6. Промойте микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE 2 раза 50 мкл 1% TFA в 80% (оба v/v) ACN, отжмите и объедините этот поток с протоком из шага 3.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинированная проточная фракция обычно содержит ~90% от общего пептидного материала, эффективно образуя немодифицированную пептидную фракцию, которая, следовательно, может быть использована для отдельного последующего анализа (вместо проведения отдельного эксперимента по типу протеомики).
    7. Перенесите микроколонки ZIC-HILIC-C8-SPE в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с низким уровнем связывания. Удерживаемые N-гликопептиды последовательно разбавляют 50 мкл 0,1% (v/v) TFA, затем 50 μL 25 мМ бикарбоната аммония, а затем 50 μL 50% (v/v) ACN. Вращайтесь со скоростью 2 000 x g в течение 60 секунд после каждого шага.
      Примечание: Элюат обычно содержит ~10% от общего объема пептидного материала, большую часть которого должны составлять N-гликопептиды, если достигается высокая эффективность обогащения. Важно следить за микроколонками после каждого вращения, чтобы убедиться, что раствор полностью пропущен, так как это будет способствовать эффективному элюированию.
    8. Соберите, объедините и высушите обогащенные N-гликопептиды и (при необходимости) немодифицированный пептид протекают через фракции в системе вакуумных концентраторов.
  4. Реверсивно-фазированный ЖХ-МС/МС интактных N-гликопептидов
    1. Приготовьте растворители LC, как описано ниже.
      1. Растворитель А: Приготовьте 1 л 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в ультрачистой воде. Обрабатывайте ультразвуком в течение 15 минут для дегазации растворителя. Растворитель А может храниться в течение одного месяца при температуре 20-25 °С.
      2. Растворитель В: Приготовьте 1 л 0,1% муравьиной кислоты в 99,9% (оба v/v) ACN. Обрабатывайте ультразвуком в течение 15 минут до дегазации. Растворитель B может храниться в течение одного месяца при температуре 20-25 °C.
    2. Суспендировать высушенные пептидные фракции в 0,1% (v/v) муравьиной кислоте до концентрации примерно 0,2-0,5 мкг пептида/мкл и тщательно перемешать. Вращайте образцы при давлении 14 000 x g в течение 5 минут, затем осторожно перенесите надосадочную жидкость во флаконы с образцами MS, оставляя около 0,5 μл, чтобы избежать переноса нежелательных частиц и мусора.
    3. Для каждого образца ввести ~0,5-1 мкг общего пептида в колонку ловушки C18-LC и разделить пептиды на аналитической колонке C18-LC с постоянной скоростью потока 250 нл/мин с помощью системы UPHLC, подключенной к масс-спектрометру, с градиентом 2%-30% растворителя B в течение 100 мин, 30%-50% B в течение 18 мин, 50%-95% B в течение 1 мин и 9 мин при 95% (все v/v) B в растворителе A (или другой подходящей конфигурации).
    4. Детектирование пептидов осуществляется с помощью масс-спектрометра высокого разрешения, подключенного к системе nanoLC, оснащенной источником ионов наноэлектроспрея и работающей в режиме положительной полярности ионов.
    5. Для MS1 используйте диапазон сканирования сбора данных m/z 350 –1 800, высокое разрешение 60 000–120 000 FWHM при m/z 200 и напряжение источника ~2,5 кВ. Установите АРУ на 3 x 106 ионов с максимальным временем накопления 50 мс (или другими подходящими настройками).
    6. Для MS/MS выберите 20 наиболее распространенных ионов-предшественников из каждого полного сканирования MS1 для фрагментации в режиме DDA с использованием HCD-MS/MS с фиксированным NCE 35% или sceHCD с NCE 25%, 35% и 45%. Важно зафиксировать нижнее значение m/z на 110 (например, диапазон сканирования m/z 110 - 1800), чтобы наблюдать все маломассивные ионы оксония в каждом спектре фрагмента.
    7. Выберите прекурсоры, несущие более 2 зарядов (Z ≥ 2) для фрагментации. Получение спектров (sce)HCD-MS/MS с разрешением 30 000-45 000 FWHM при m/z 200 с АРУ 1 x 105 ионов и временем накопления 90 мс с использованием окна выделения предшественника ± 1,0 Th. Обеспечьте динамическое исключение через 30 с после одиночной изоляции и фрагментации данного иона-предшественника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ЭТД доступна, рассмотрите возможность также получения EThcD-МС/МС интактных образцов N-гликопептида с использованием продукта-зависимого ионного запуска. Выполняйте этот шаг, когда диагностические ионы оксония гликана (например, m/z 138.0545, 204.0867 и 366.1396) входят в число 20 основных ионов фрагментов в каждом спектре39 HCD-MS/MS. Детектирование фрагментов EThcD-МС/МС с разрешением 30 000-45 000 FWHM при m/z 200 с АРУ 4 x 105 ионов, временем инжекции 250 мс, NCE HCD 15% и шириной изоляции предшественника 1,6 Th.
  5. Анализ данных гликопротеомики ЖХ-МС/МС
    1. Подтвердить обогащение исходных данных ЖХ-МС/МС N-гликопептидами, проверив, что большинство спектров ГХД-МС/МС содержат ионы оксония гликана (например, m/z 138.0545, 204.0867 и 366.1396) и (для стратегий мечения) характеризуются базовым разделением маломассовых репортерных ионов TMT, высокой эффективностью фрагментации в спектрах МС/МС и узкой шириной пика ЛК, а также высокой точностью МС. и соотношение сигнал/шум.
    2. Используя поисковую систему (доступно несколько; см. ниже), выполните поиск данных МС/МС на наличие интактных N-гликопептидов по подходящей базе данных белков/пептидов, нацеленной на исследуемый образец (например, полученный в результате эксперимента по де-N-гликопротеомике) или по всем рассмотренным человеческим белкам UniProtKB. Подготовьте поиск против пептидного N-гликозилирования путем поиска пептидов с локализованным пайетами Asn. Важно выбрать базу данных N-гликанов, основанную на гликомике, т.е. гликаны, идентифицированные по гликомическим данным на шаге 2, чтобы ограничить пространство поиска гликанами, о которых известно, что они существуют в образце (образцах).
      Параллельный поиск с использованием широкой предопределенной базы данных N-гликанов может быть рассмотрен для исключения существования дополнительных N-гликановых композиций в данных.
    3. Настройте остальные переменные поиска в соответствии с изучаемой выборкой, конкретными выполненными процедурами обработки выборки, а также используемыми настройками MS и используемыми инструментами. Общие настройки поиска для поиска данных N-гликопротеомики включают:
      Допуск по массе прекурсора и продукта: 10 ppm и 20 ppm
      Специфичность протеазы: полностью специфичная и/или полуспецифичная (N-рваная)
      Допустимые пропущенные спайности: 2
      Исправлены модификации: карбамидметилирование Cys (+57.021 Da)
      Переменные модификации: Метическое окисление (+15,994 Да) (общее 1)
      Допустимые вариабельные модификации на пептид: 1 или 2
      Модификации гликанов: база данных гликанов на основе гликомики (редко 1)
      База данных белковых приманок и загрязняющих веществ: включено
    4. Отфильтруйте все поисковые запросы по <1% ложных открытий (FDR) на уровне белка и пептида. Рассматривайте только N-гликопептиды, идентифицированные с высокой степенью достоверности (например, оценки PEP 2D < 0,001) и выполняйте ручную аннотацию/курирование отфильтрованного выхода, чтобы еще больше снизить частоту неправильной идентификации N-гликопептидов, как описано 36,40,41.
      Примечание: Гликопептиды с сиалированными и мультифукозилированными N-гликанами и гликопептиды, несущие другие вариабельные модификации в дополнение к гликанам (т.е. окисление Met и деамидирование Asn/Gnn), особенно подвержены неправильной интерпретации поисковымисистемами. Особое внимание следует уделять проверке таких кандидатов до представления отчетности.

Результаты

В этом разделе представлены репрезентативные результаты метода гликопротеомики под контролем гликомики, примененного к тканевому стеклу FFPE у пациента с КРР на стадии II.

Для получения достаточного количества исходного материала белка для протокола бе...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
В этом протокольном документе мы шаг за шагом описали метод гликопротеомики, управляемый гликомикой, который обеспечивает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеомии в сложной ТМЭ.

Ва...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

ТГК поддерживается стипендией Международной программы подготовки исследователей, финансируемой правительством Австралии. NB поддерживается Международными стипендиями Университета Маккуори за выдающиеся достижения в области исследований, финансируемыми Университетом Маккуори. AC поддерживается стипендией Программы исследовательской подготовки, финансируемой правительством Австралии. РК был поддержан Институтом рака Нового Южного Уэльса (ECF181259). MTA является получателем стипендии Австралийского исследовательского совета Future Fellowship (FT210100455).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium acetate Sigma AldrichA1542Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%Sigma AldrichA6141Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS gradeSigma Aldrich34851Alternatives available
Bovine fetuinSigma AldrichF3004Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatives available
EthanolSigma AldrichE7023Alternatives available
Formic acid, LC-MS gradeSigma Aldrich00940Alternatives available
Glacial acetic acidSigma AldrichA6283Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatives available
MethanolSigma AldrichM1775Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin PromegaV5113Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS gradeSigma AldrichT7408Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS gradeSigma AldrichT6508Alternatives available
Tools/Materials
C18 disksEmpore66883-U
C8 disksEmpore66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMilliporeIPVH20200Pore size: 0.45 μm 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069Alternatives available
Microcentrifuge adapters The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resinThermo1133903Particle size 30 μm
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind tubes 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatives available
Single hole puncherSwingline74005
SpeedVac concentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resinSupelco57088Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatives available
Temperature-controlled incubatorThermolineE7.30Alternatives available
Ultrasonic bathUnisonicsFXPAlternatives available
ZIC-HILIC resinMerck150455Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns MilliporeZTC18S096Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system AgilentAlternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resinDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System ThermoAlternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column ThermoDiscontinuedParticle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U). 
LCMS-grade acetonitrileLiChrosolv100029Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics) ThermoAlternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)ThermoOther high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mLThermoTHC11093563Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching capsThermoTHC09150869Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 or higherCommercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 or higherCommercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoModExpasyOpen access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeatVAST Scientificv2.1Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 or higherOpen access software for relative quantitation of glycans
XcaliburThermov2.2 or higherFor browsing raw LC-MS/MS data

Ссылки

  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. . Essentials of glycobiology. , 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024 (2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12 (2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48 (2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. . Essentials of glycobiology. , 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. . Essentials of glycobiology. , 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179 (2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516 (2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139 (2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216 (2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026 (2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272 (2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586 (2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037 (2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740 (2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054 (2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25 (2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238 (2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057 (2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822 (2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030 (2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144 (2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

216

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены