JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo di glicoproteomica guidato dai glifumetti, una tecnologia omica integrata che offre informazioni complete sul glicoproteoma eterogeneo in microambienti tumorali complessi necessari per comprendere meglio la glicobiologia dei tumori.

Abstract

La glicosilazione è una modifica proteica comune e strutturalmente diversificata che influisce su un'ampia gamma di processi tumorigenici. La glicomica e la glicoproteomica guidate dalla spettrometria di massa sono emerse come potenti approcci per analizzare rispettivamente i glicani liberati e i glicopeptidi intatti, offrendo una comprensione più profonda del glicoproteoma eterogeneo nel microambiente tumorale (TME). Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo glicoproteomico guidato dai glifumetti, una tecnologia omica integrata, che impiega inizialmente glicomici porosi a base di carbonio-LC-MS/MS grafitato per chiarire le strutture dei glicani e la loro distribuzione quantitativa nel glicoma dei tessuti tumorali, delle popolazioni cellulari o dei fluidi corporei oggetto di indagine. Ciò consente un'analisi comparativa della glicomica per identificare la glicosilazione alterata tra gruppi di pazienti, stadi di malattia o condizioni e, soprattutto, serve a migliorare l'analisi glicoproteomica a valle degli stessi campioni creando una libreria di strutture di glicani note, riducendo così il tempo di ricerca dei dati e il tasso di identificazione errata delle glicoproteine. Concentrandosi sulla profilazione dell'N-glicoproteoma, le fasi di preparazione del campione per il metodo di glicoproteomica guidata dai gliomi sono descritte in dettaglio in questo protocollo e vengono discussi gli aspetti chiave della raccolta e dell'analisi dei dati. Il metodo della glicoproteomica guidata dai gliomi fornisce informazioni quantitative sulle glicoproteine presenti nel TME e sui loro siti di glicosilazione, sull'occupazione del sito e sulle strutture dei glicani sito-specifiche. I risultati rappresentativi sono presentati da tessuti tumorali inclusi in paraffina fissati in formalina di pazienti con cancro del colon-retto, dimostrando che il metodo è sensibile e compatibile con le sezioni di tessuto comunemente presenti nelle biobanche. La glicoproteomica guidata dai glifumetti, quindi, offre una visione completa dell'eterogeneità e della dinamica del glicoproteoma nei TME complessi, generando solidi dati biochimici necessari per comprendere meglio la glicobiologia dei tumori.

Introduzione

La glicosilazione delle proteine è un tipo prevalente e complesso di modificazione co- e post-traduzionale delle proteine prodotte dalle specie dell'albero filogenetico della vita 1,2,3. È noto che i glicani legati alle proteine hanno un impatto su un'ampia gamma di processi biologici importanti per la salute umana, tra cui la mediazione e la regolazione delle interazioni cellulari e degli eventi di comunicazione 4,5. Si ritiene che la glicosilazione proteica aberrante sia una causa di trasformazione maligna, progressione tumorale e diffusione 6,7,8. Ciò coinvolge i glicani nei processi tumorigenici chiave nel microambiente tumorale (TME) e offre un potenziale considerevole e in gran parte non sfruttato per la scoperta di biomarcatori basati sui glicani e applicazioni terapeutiche. La glicobiologia sta quindi ricevendo una crescente attenzione nella ricerca sul cancro e nelle scienze della vita9.

Alimentati dagli sviluppi chiave della glicoanalitica e dell'informatica nell'ultimo decennio 10,11,12,13,14,15,16,17, i glicomici e la glicoproteomica guidati dalla cromatografia liquida e dalla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) si sono affermati come potenti strumenti per la profilazione a livello di sistema di glicani liberati e glicopeptidi intatti da miscele complesse di glicoproteine estratte direttamente dalle loro origini di campioni biologici come vari tipi di campioni di pazienti oncologici (ad esempio, tessuti tumorali, popolazioni cellulari, fluidi corporei)3,13,18,19,20.

La glicomica fornisce informazioni sulla struttura e la quantità del repertorio dei glicani (il glicoma), che è prodotto dinamicamente da cellule, tessuti e persino interi organismi. D'altra parte, la glicoproteomica fornisce informazioni quantitative sui trasportatori proteici e sul loro sito di glicosilazione, sui tassi di occupazione del sito (macro-eterogeneità), sulle composizioni dei glicani sito-specifici e sul loro modello di distribuzione del sito (micro-eterogeneità) con informazioni strutturali limitate sui glicani (spesso limitate alla composizione dei glicani)15,16,21. Pertanto, la glicomica e la glicoproteomica sono approcci complementari per esaminare i dettagli biochimici del glicoproteoma22.

Una miriade di disegni metodologici e strategie analitiche per la glicomica e la glicoproteomica sono stati sviluppati e applicati in tutti i laboratori a seconda del glicoanalita di interesse (ad esempio, N-/O-/C-linked, glicano/glicopeptide/glicoproteina, marcato/non marcato), della natura del campione (ad esempio, cellule, tessuti, fluidi corporei), della quantità (livelli di proteine nanogrammi/microgrammi/milligrammi) e dello strumento analitico disponibile23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Nonostante i vantaggi riconosciuti del loro uso parallelo, la glicomica e la glicoproteomica non sono comunemente applicate insieme, ma piuttosto come approcci autonomi negli studi di ricerca glicobiologica e sul cancro a causa della loro elevata richiesta di competenze analitiche e strumentazione specializzata.

Riconoscendo questa lacuna tecnologica, più di un decennio fa, abbiamo introdotto il metodo della glicoproteomica assistita da glicomica, che è in grado di integrare dati glicomici e glicoproteomici ottenuti da campioni biologici complessi33. In sintesi, la tecnologia glicoproteomica assistita da glicomici (o guidata da glicomici come in questo protocollo) profila gli N- e/o O-glicani attraverso un consolidato carbonio grafitato poroso (PGC) metodo LC-MS/MS34,35, che vengono poi utilizzati per l'analisi di dati intatti di N- e/o O-glicopeptidi acquisiti dallo stesso campione o dagli stessi campioni definendo i confini dello spazio di ricerca dei glicani36. PGC-LC-MS/MS è un metodo glicomico particolarmente potente in quanto fornisce informazioni quantitative sul glicoma con elevata sensibilità e risoluzione strutturale, fornendo informazioni sulla topologia (sequenza monosaccaridica e pattern di ramificazione) e sui legami glicosidici dei glicani anche all'interno di miscele complesse 35,37,38 . Il flusso di lavoro della glicoproteomica prevede la generazione di peptidi, la marcatura opzionale dei peptidi, il multiplexing e il prefrazionamento, nonché l'arricchimento prima dell'analisi LC-MS/MS in fase inversa che impiega idealmente diversi metodi di frammentazione, tra cui l'energia di collisione a gradini/dissociazione collisionale ad alta energia (sceHCD, per N-glicopeptidi) e il trasferimento di elettroni/dissociazione collisionale ad alta energia (EThcD, per O-glicopeptidi) per l'identificazione dell'analita. Per l'analisi dell'N-glicoproteoma, la de-N-glicoproteomica parallela può guidare l'analisi dei dati di N-glicopeptidi intatti definendo lo spazio di ricerca proteina/peptide e fornendo maggiori dettagli sui siti di N-glicosilazione occupati e sul loro tasso di occupazione del sito, mentre l'analisi parallela di peptidi non modificati rivela eventuali variazioni del livello proteico tra le condizioni studiate.

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato e facile da seguire passo dopo passo per il metodo della glicoproteomica guidata dai glifumetti (vedere la Figura 1 per una panoramica del flusso di lavoro). Il protocollo fornisce dettagli sperimentali sulle fasi di preparazione del campione e sugli esperimenti di glicomica e glicoproteomica basati su LC-MS/MS e presenta risultati rappresentativi che dimostrano l'applicazione del metodo a sezioni di tessuto FFPE (FFPE) fissate in formalina di tumori resecati da pazienti con cancro del colon-retto (CRC), consentendo di comprendere la glicobiologia del TME in un prezioso tipo di campione archiviato nelle biobanche oncologiche di tutto il mondo. Vengono inoltre brevemente discusse l'analisi e l'integrazione dei dati di glicomica e glicoproteomica.

figure-introduction-7463
Figura 1: Panoramica del metodo glicoproteomico guidato dai glifumetti. La panoramica mostra le fasi sperimentali dettagliate nei flussi di lavoro della glicomica (a sinistra) e della glicoproteomica (a destra), con una panoramica delle informazioni ottenute (in grassetto) e di come i due approcci sono integrati attraverso una migliore analisi e interpretazione dei dati. Inserto: Microcolonne SPE autoprodotte utilizzate per i flussi di lavoro (i) glicomica e (ii-iii) glicoproteomica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana (Scienze Mediche) presso la Macquarie University, Sydney, Australia (Protocollo 5201800073).

NOTA: Il metodo della glicoproteomica guidata dai gliomi può essere applicato a un insieme diversificato di campioni biologici che vanno dalla complessità glicoproteica bassa a quella estrema. Per gli approcci di glicoproteomica label-free (in cui non viene eseguito il pooling dei campioni), sono necessari circa 100-200 μg di proteine totali da miscele complesse come materiale di partenza per garantire un'elevata copertura di glicoproteoma dopo l'arricchimento per glicopeptidi che possono costituire solo l'1%-10% della popolazione peptidica. A causa di limiti di spazio, l'estrazione iniziale delle proteine da cellule o tessuti viene tralasciata e i lettori vengono indirizzati ad altre risorse15. Glycomics consuma conservativamente ~10-20 μg di proteine per analisi per la profilazione profonda del glicoma, lasciando la maggior parte dell'estratto proteico per la glicoproteomica. Se non diversamente specificato, sono state menzionate le concentrazioni finali e le sostanze chimiche devono essere disciolte in acqua di altissima qualità per ottenere soluzioni acquose nel protocollo seguente.

1. Preparazione proteica

  1. Determinare la concentrazione proteica degli estratti utilizzando un metodo consolidato (ad esempio, acido bicinchoninico o saggi proteici di Bradford). Regolare la concentrazione proteica a 10 μg/μL in 50 mM TEAB (pH 8,5).
  2. Ridurre i legami disolfuro incubando i campioni con 10 mM di DTT per 45 minuti a 56 °C. Gruppi tiolici privi di alchilati incubando successivamente campioni con 40 mM di IAA al buio per 30 minuti a 20-25 °C. Estinguere la reazione di alchilazione con un eccesso di DTT (~40 mM).
  3. Dividi ogni campione di proteine. Consentire circa 10-20 μg di proteine totali per i glicomi e 100-200 μg di proteine totali per il flusso di lavoro della glicoproteomica.
    NOTA: Oltre ai campioni proteici di interesse, includere un modello noto di glicoproteina (ad esempio, fetuina bovina) o una miscela proteica (ad esempio, lisato di linea cellulare, plasma) per valutare l'efficienza e la riproducibilità delle procedure e per monitorare le prestazioni della LC-MS/MS.

2. Flusso di lavoro N-glicomico

  1. Immobilizzazione di proteine su una membrana in PVDF
    1. Utilizzare un perforatore a foro singolo per tagliare il raccordo della membrana in PVDF con il numero di campioni di proteine da individuare.
    2. Bagnare le membrane asportate con etanolo o metanolo, quindi trasferire le membrane in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
    3. Una volta che le membrane sono quasi asciutte, depositare i campioni proteici in un volume massimo di 2,5 μl per punto per ridurre al minimo la superficie del campione proteico depositato. Se necessario, riposizionare i campioni in modo che la quantità totale di proteina immobilizzata sul posto sia di ~10-20 μg. Per fare ciò, lasciare asciugare la macchia all'aria prima di ripetere la procedura di spotting.
      NOTA: Durante la smacchiatura, potrebbe essere necessario bagnare nuovamente la membrana con etanolo o metanolo per evitare che le membrane si asciughino completamente.
    4. Asciugare le membrane all'aria a 20-25 °C per almeno 3 ore, preferibilmente durante la notte. Evitare qualsiasi contaminazione delle membrane durante l'essiccazione.
      NOTA: Come fase opzionale del controllo di qualità, le proteine individuate sulle membrane possono essere visualizzate colorando con la soluzione Direct Blue 71 come descritto in precedenza34.
  2. Rilascio di N-glicani legati alle proteine
    1. Aggiungere 100 μl di PVP40 all'1% (p/v) in metanolo a ciascun pozzetto contenente le membrane maculate. Assicurarsi che il lato della membrana su cui è stato individuato il campione di proteine sia rivolto verso l'alto durante tutta la preparazione del campione.
    2. Agitare la piastra nella soluzione PVP40 per 5 minuti a 20-25 °C, quindi scartare la soluzione PVP40.
      NOTA: La soluzione PVP40 blocca le membrane in PVDF e i pozzetti per prevenire il legame non specifico della PNGasi F (e di eventuali esoglicosidasi che possono essere applicate per ottenere informazioni specifiche per il linkage in esperimenti paralleli; vedere la discussione di seguito) nelle fasi successive.
    3. Lavare ogni pozzetto contenente le macchie proteiche ostruite con 100 μL di acqua ultrapura e agitare la piastra per 5 minuti. Ripeti questo passaggio 3 volte. Assicurarsi che l'acqua sia completamente scartata dopo ogni lavaggio.
    4. Aggiungere 15 μL di soluzione PNGasi F (0,5 U/μL, diluita in acqua ultrapura dalla soluzione madre da 10 U/μL) in ciascun pozzetto, supponendo che siano stati depositati 15 μg di proteine per campione.
    5. Aggiungere acqua ai pozzetti vuoti circostanti per evitare la disidratazione del campione durante le fasi successive dell'incubazione e utilizzare una pellicola trasparente per sigillare accuratamente la piastra. Incubare la piastra per almeno 8 ore a 37 °C.
    6. Sonicare la piastra per 5 minuti per aiutare le goccioline evaporate sul lato dei pozzetti a raccogliersi sul fondo della piastra.
    7. Trasferire con cura i campioni di N-glicano rilasciati in provette da microcentrifuga individuali (1,5 mL). Lavare i pozzetti del campione 2 volte con 20 μL di acqua ultrapura, quindi erogare e aspirare più volte. Combinare il campione rimanente da ciascun pozzetto nelle provette per microcentrifuga contenenti i campioni di N-glicano.
      NOTA: Evitare l'uso di provette a basso legame per la preparazione del campione N-glicomico, poiché i glicani idrofili possono legarsi irreversibilmente alle provette rivestite.
    8. Aggiungere 10 μl di acetato di ammonio 100 mM pH 5.0 e incubare i campioni per 1 ora a 20-25 °C.
      NOTA: Questo passaggio idrossila i residui di N-acetilglucosamina amminati sull'estremità riducente degli N-glicani rilasciati, consentendo una riduzione esaustiva nel passaggio successivo. Regolare 100 mM di acetato di ammonio a pH 5,0 poiché alti tassi di conversione da glicosilammina a ossidrile nell'estremità riducente degli N-glicani staccati dipendono dalla debole acidità della soluzione.
    9. Essiccare i campioni di N-glicano in un sistema di concentrazione sottovuoto.
  3. Riduzione degli N-glicani liberati
    1. Aggiungere 20 μL di 1 M NaBH4 in 50 mM KOH appena preparato ai campioni di N-glicani essiccati e mescolare accuratamente.
      NOTA: NaBH4 deve essere preparato al momento in KOH il giorno in cui viene utilizzato.
    2. Chiudere ermeticamente i coperchi di ciascuna provetta e incubare i campioni per 3 ore a 50 °C.
      NOTA: Gli N-glicani subiscono una riduzione, che converte gli anomeri α e β dell'estremità riducente in una singola forma di alditolo, portando a un singolo picco cromatografico nell'analisi PGC-LC-MS/MS.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette del campione in una microcentrifuga per portare il liquido sul fondo delle provette.
    4. Aggiungere 100 μl di acqua ultrapura a ciascun campione. Aggiungere 2 μL di acido acetico glaciale per neutralizzare i campioni alcalini di N-glicano. Ruotare le provette dei campioni in una microcentrifuga per portare i campioni sul fondo delle provette.
      NOTA: L'acido acetico glaciale neutralizza i campioni alcalini che portano alla formazione di idrogeno gassoso (H2) e alla successiva effervescenza durante la reazione.
  4. Desalinizzazione di N-glicani con PGC-C18-SPE
    1. Preparare le microcolonne PGC-C18-SPE fatte in casa come descritto di seguito.
      1. Utilizzando una siringa adatta, collegare e trasferire i dischi C18 su puntali per pipette adatti (10 μl).
        NOTA: Qui possono essere utilizzate anche microcolonne commerciali C18-SPE.
      2. Pipettare 10 μL di impasto di resina PGC sospeso in metanolo al 50% (v/v) nelle microcolonne C18-SPE. Posizionare le microcolonne in provette da 2 mL dotate di adattatori per microcentrifuga. Ruotare i tubi per creare microcolonne PGC-C18-SPE con un'altezza della colonna di ~0,5 cm (vedere la Figura 1i). Preparare una microcolonna PGC-C18-SPE per ogni campione.
        NOTA: L'uso di adattatori assicura che le microcolonne siano sospese al centro del tubo.
      3. Per le successive fasi di lavaggio e caricamento dei campioni, impostare una centrifuga da banco a 6.000 giri/min (~2.000 x g) e centrifugare per 60 s per facilitare il passaggio delle fasi mobili attraverso le microcolonne PGC-C18-SPE. Lavare e condizionare ciascuna microcolonna PGC-C18-SPE in sequenza con 50 μL di TFA allo 0,1% (v/v) in ACN tre volte, seguiti da 50 μL di TFA allo 0,1% (v/v) per tre volte.
        NOTA: Le microcolonne PGC-SPE possono essere preparate con ore di anticipo, ma devono essere conservate idratate a temperatura ambiente prima dell'uso.
    2. Applicare i campioni di N-glicano alle microcolonne PGC-C18-SPE in un volume di carico fino a 40 μL e centrifugare a 6.000 giri/min (~2.000 x g) per 60 s dopo ogni aggiunta. Ripetere la fase di caricamento fino a quando l'intero campione di N-glicano non è stato applicato alla microcolonna.
      NOTA: Sebbene le frazioni a flusso continuo non debbano contenere glicani, si consiglia di conservare queste frazioni fino a quando i dati glicomici non sono stati acquisiti con successo in caso di ritenzione incompleta sulle microcolonne PGC-C18-SPE.
    3. Lavare le microcolonne PGC-C18-SPE con 20 μL di acqua ultrapura. Trasferire le microcolonne PGC-C18-SPE in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL in preparazione per l'eluizione di N-glicano.
    4. Eluire gli N-glicani aggiungendo 40 μL di TFA allo 0,1% in ACN al 50% (entrambi v/v) a ciascuna microcolonna PGC-C18-SPE, quindi centrifugare. Ripetere questa procedura e unire l'eluato.
      NOTA: È importante monitorare le microcolonne dopo ogni centrifuga per assicurarsi che la soluzione sia stata completamente centrifugata, in quanto ciò faciliterà un'eluizione efficiente.
    5. Essiccare gli N-glicani dissalati in un sistema di concentrazione sottovuoto.
  5. Acquisizione PGC-LC-MS/MS
    1. Preparare i solventi LC come descritto di seguito.
      1. Solvente A: Preparare 100 mL di soluzione madre di bicarbonato di ammonio 100 mM (NH4HCO3) in acqua ultrapura. Filtrare la soluzione madre attraverso un disco filtrante in nylon da 0,2 μm utilizzando un'unità di filtrazione sottovuoto per rimuovere il particolato. Quindi, preparare 1 L di soluzione 10 mM NH4HCO3 (solvente A) diluendo 100 mL di soluzione madre 100 mM NH4HCO3 in 900 mL di acqua ultrapura. Sonicare il solvente A per 15 minuti per degassare la soluzione. Il solvente A può essere conservato per 1 settimana a 20-25 °C, mentre la soluzione madre NH4HCO3 da 100 mM può essere conservata per 1 mese a 4 °C.
      2. Solvente B: Preparare 1 L di 10 mM NH4HCO3 in ACN al 70% (v/v) in acqua ultrapura (solvente B) aggiungendo 100 mL di soluzione madre 100 mM NH4HCO3 (vedere il passaggio precedente 2.5.1.2) a 700 mL di ACN e diluire fino a un volume totale di 1 L con acqua ultrapura. Sonicare il solvente B per 15 minuti per degassare. Il solvente B può essere conservato per 2 settimane a 20-25 °C.
    2. Risospendere gli N-glicani dissalati in 10 μL di acqua ultrapura e mescolare accuratamente. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 5 minuti, quindi trasferire con cura il surnatante nelle fiale per campioni MS, lasciando circa 0,5 μl per evitare il trasferimento di particelle e detriti visibili o invisibili che danneggerebbero il sistema LC-MS/MS.
    3. Iniettare e separare gli N-glicani su una colonna capillare PGC-LC riscaldata a 50 °C utilizzando un gradiente lineare di 60 minuti (o altrimenti appropriato) di solvente B allo 0%-70% (v/v) nel solvente A su un sistema HPLC. Assicurarsi che il sistema HPLC sia collegato allo spettrometro di massa e funzioni con una portata costante di 20 μl/min (regolare la portata in modo che corrisponda alla geometria della colonna PGC-LC).
    4. Rilevare gli N-glicani separati utilizzando uno spettrometro di massa a quadrupolo a trappola ionica lineare (o un altro sistema MS adatto a bassa o alta risoluzione) installato con una sorgente ionica elettrospray e funzionante in modalità di polarità ionica negativa.
    5. Impostare l'intervallo di scansione di acquisizione MS1 su m/z 150-2.000 con una larghezza di picco della scansione zoom di m/z 0,25 a metà larghezza massima (FWHM) a m/z 200. Impostare la tensione di sorgente su 3,2 kV. Per le scansioni MS1, impostare il controllo automatico del guadagno (AGC) su 5 x 104 ioni con un tempo di accumulo massimo di 50 ms (o altre impostazioni appropriate).
      NOTA: Il basso m/z iniziale deve includere il rilevamento di mono- e di-saccaridi che spesso contribuiscono al glicoma N e O.
    6. Per MS/MS, impostare la risoluzione su m/z 0,25 FWHM a m/z 200, l'AGC su 2 x 104 ioni e il tempo di accumulo massimo su 300 ms. Abilita l'acquisizione dipendente dai dati (DDA) e seleziona i cinque precursori più abbondanti in ogni scansione completa MS1 per la frammentazione utilizzando l'attivazione della risonanza (trappola ionica) e la dissociazione indotta da collisione (CID) a un'energia di collisione normalizzata (NCE) del 33%. Deselezionare l'esclusione dinamica per evitare di perdere gli isomeri isobarici N-glicani a eluizione ravvicinata.
  6. Analisi dei dati glicomici LC-MS/MS
    1. Sfoglia i dati grezzi LC-MS/MS generati utilizzando il software appropriato per garantire un'elevata qualità dei dati dopo aver confermato la larghezza del picco LC stretta, l'efficace separazione degli isomeri N-glicani, l'elevata precisione MS, la risoluzione e il rapporto segnale/rumore e l'elevata efficienza di frammentazione CID-MS/MS.
    2. Identificare manualmente gli N-glicani nel campione in base alla massa del precursore monoisotopico, al modello di frammentazione CID-MS/MS e al tempo di ritenzione PGC-LC relativo e assoluto.
      NOTA: RawMeat v2.1, GlycoMod e GlycoWorkBench v2.1 possono aiutare il processo di identificazione come descritto26. I vincoli biosintetici noti e la correlazione strutturale tra gli analiti osservati possono anche aggiungere ulteriore fiducia negli N-glicani identificati26. In alternativa, l'identificazione semiautomatica dei glicani e l'annotazione spettrale possono essere eseguite utilizzando un software commerciale.
    3. Per la quantificazione relativa degli N-glicani, generare un elenco di transizione contenente il precursore monoisotopico m/z di tutti gli isomeri N-glicani identificati e utilizzare un software commerciale per determinare i valori dell'area sotto la curva (AUC) sulla base dei cromatogrammi ionici estratti (EIC) di tutti gli ioni precursori degli N-glicani come descritto26.

3. Flusso di lavoro della N-glicoproteomica

  1. Digestione della miscela proteica
    1. Digerire 100-200 μg dell'estratto proteico ridotto e alchilato (dalla parte 1) aggiungendo tripsina (rapporto enzima:proteine 1:50, p/p) e/o altre proteasi a scelta a ciascun campione.
      NOTA: A differenza della preparazione del campione glicomico, utilizzare, se possibile, provette per microcentrifuga a basso legame per le fasi di preparazione del campione di glicoproteomica per il massimo recupero dei peptidi.
    2. Incubare i campioni per 8-12 ore a 37 °C. Assicurarsi che il pH sia ~8,5 poiché una soluzione leggermente alcalina migliora l'efficienza della digestione della tripsina.
      NOTA: Sono preferite proteasi specifiche che producono modelli di scissione prevedibili e lasciano la maggior parte degli N-glicopeptidi con un singolo sequon (sito di glicosilazione), come la tripsina e la lisi-C. Evitare di incubare eccessivamente i campioni per ridurre le scissioni non specifiche delle proteine da parte della tripsina o di altre proteasi.
    3. Arrestare la digestione per acidificazione (per evitare scissioni aspecifiche indotte da una digestione prolungata) con l'aggiunta dell'1% (v/v) di TFA.
  2. Desalinizzazione dei peptidi con Oligo R3-C18-SPE
    1. Preparare le microcolonne Oligo R3-C18-SPE fatte in casa come descritto di seguito.
      1. Utilizzando una siringa adatta, collegare e trasferire i dischi C18 su puntali per pipette da 10 μl.
        NOTA: Qui possono essere utilizzate anche microcolonne commerciali C18-SPE.
      2. Depositare un impasto di resina Oligo R3 sospeso in ACN pulito nelle microcolonne C18-SPE. Posizionare le microcolonne in provette da 2 mL dotate di adattatori per microcentrifuga per garantire che le microcolonne siano sospese al centro della provetta e ruotare per creare microcolonne Oligo R3-C18-SPE con un'altezza della colonna di ~1 cm (vedere la Figura 1ii). Preparare una microcolonna Oligo R3-C18-SPE per ogni campione.
    2. Per le successive fasi di lavaggio e caricamento dei campioni, regolare una centrifuga da banco a 6.000 giri/min (~2.000 x g) e centrifugare per 60 s per consentire alle fasi mobili di passare attraverso le microcolonne Oligo R3-C18-SPE. Lavare e condizionare ciascuna microcolonna Oligo R3-C18-SPE in sequenza con 50 μL di ACN pulito, 3x, e poi 50 μL di TFA allo 0,1% (v/v), 3x.
      NOTA: Le microcolonne Oligo R3-C18-SPE possono essere preparate in anticipo e conservate idratate per ore a temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Posizionare le microcolonne Oligo R3-C18-SPE condizionate in nuove provette da 1,5 mL insieme agli adattatori per microcentrifuga. Applicare le miscele di peptidi digeriti in triptico alle microcolonne Oligo R3-C18-SPE e centrifugare a 2.000 x g per 60 s. Possono essere necessari più cicli di caricamento per volumi di campione superiori a 50 μl.
    4. Lavare le microcolonne Oligo R3-C18-SPE con 50 μL di TFA allo 0,1% (v/v), 3x. Trasferire le microcolonne Oligo R3-C18-SPE in nuove provette da 1,5 mL in preparazione per l'eluizione dei peptidi desalini.
    5. Eluire i peptidi desalinizzati applicando 50 μL di TFA allo 0,1% in ACN al 50% (entrambi v/v), seguiti da 50 μL di TFA allo 0,1% in ACN al 70% (entrambi v/v) a ciascuna microcolonna Oligo R3-C18-SPE. Gira dopo ogni passaggio.
      NOTA: È importante monitorare le microcolonne dopo ogni centrifuga per assicurarsi che la soluzione sia stata completamente centrifugata, in quanto ciò faciliterà un'eluizione efficiente.
    6. Raccogliere, combinare ed essiccare i peptidi dissalati in un sistema di concentrazione sottovuoto.
      NOTA: Se si eseguono proteomica e de-N-glicoproteomica parallele (vedere Discussione), dividere i campioni di peptidi desalinizzati e mettere da parte frazioni separate prima dell'essiccazione.
  3. Arricchimento di N-glicopeptide mediante ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Preparare le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE fatte in casa come descritto di seguito.
      1. Utilizzando una siringa adatta, collegare e trasferire i dischi C8 su puntali per pipette da 10 μl.
      2. Depositare un impasto di resina ZIC-HILIC sospeso in metanolo nelle microcolonne C8-SPE. Posizionare le microcolonne in provette da 2 mL dotate di adattatori per microcentrifuga per garantire che le microcolonne siano sospese al centro della provetta e ruotare per creare microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE con un'altezza della colonna di ~1 cm (vedere la Figura 1iii). Preparare una microcolonna ZIC-HILIC-C8-SPE per ogni campione.
    2. Per le successive fasi di lavaggio e caricamento dei campioni, regolare una centrifuga da banco a 6.000 giri/min (~2.000 x g) e centrifugare per 60 s per consentire alle fasi mobili di passare attraverso le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE. Lavare e condizionare ogni microcolonna ZIC-HILIC-C8-SPE in sequenza con 50 μL di metanolo, 3x, e poi 50 μL di acqua ultrapura, 3x, e infine 50 μL di TFA all'1% in ACN all'80% (entrambi v/v), 3x.
      NOTA: Le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE possono essere preparate con ore di anticipo, ma devono essere conservate idratate a temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Risospendere le miscele peptidiche essiccate destinate all'arricchimento di N-glicopeptidi in 50 μl di TFA all'1% in ACN all'80% (entrambi v/v) e mescolare accuratamente.
      NOTA: Se i peptidi sono difficili da risciogliere nel solvente di caricamento HILIC, i peptidi possono essere prima ridisciolti in TFA al 10% (v/v) e poi rapidamente diluiti in ACN per raggiungere le concentrazioni del solvente di caricamento HILIC. Evitare di riscaldare il campione mentre si è in alta concentrazione di TFA per evitare di indurre l'idrolisi.
    4. Posizionare le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE condizionate in nuove provette da 1,5 mL insieme agli adattatori per microcentrifuga. Applicare le miscele di peptidi risospese sulle microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE e centrifugare a 2.000 x g per 60 s. Possono essere necessari più cicli di caricamento per volumi di campione superiori a 50 μl.
    5. Raccogliere le frazioni a flusso continuo e riapplicare le frazioni alla stessa microcolonna ZIC-HILIC-C8-SPE. Ripetere la riapplicazione 2 volte e mantenere i tubi a flusso continuo.
    6. Lavare le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE 2 volte con 50 μl di TFA all'1% in ACN all'80% (entrambi v/v), centrifugare e combinare questo flusso con il flusso del passaggio 3.3.4.
      NOTA: La frazione combinata di flusso continuo contiene tipicamente ~90% del materiale peptidico totale, formando efficacemente la frazione peptidica non modificata che, quindi, può essere utilizzata per analisi a valle separate (piuttosto che eseguire un esperimento di tipo proteomico separato).
    7. Trasferire le microcolonne ZIC-HILIC-C8-SPE nelle nuove provette per microcentrifuga a basso legame da 1,5 mL. Eluire gli N-glicopeptidi trattenuti in sequenza con 50 μL di TFA allo 0,1% (v/v), seguiti da 50 μL di bicarbonato di ammonio 25 mM e quindi 50 μL di ACN al 50% (v/v). Centrifugare a 2.000 x g per 60 s dopo ogni passaggio.
      NOTA: L'eluato contiene tipicamente ~10% del materiale peptidico totale, la maggior parte del quale dovrebbe essere N-glicopeptidi se si raggiunge un'elevata efficienza di arricchimento. È importante monitorare le microcolonne dopo ogni centrifuga per assicurarsi che la soluzione sia stata completamente centrifugata, in quanto ciò faciliterà un'eluizione efficiente.
    8. Raccogliere, combinare ed essiccare gli N-glicopeptidi arricchiti e (se necessario) il flusso di peptidi non modificati attraverso frazioni in un sistema di concentratori sotto vuoto.
  4. LC-MS/MS a fase inversa di N-glicopeptidi intatti
    1. Preparare i solventi LC come descritto di seguito.
      1. Solvente A: Preparare 1 L di acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua ultrapura. Sonicare per 15 minuti per degassare il solvente. Il solvente A può essere conservato per un mese a 20-25 °C.
      2. Solvente B: Preparare 1 L di acido formico allo 0,1% in ACN al 99,9% (entrambi v/v). Sonicare per 15 minuti per degassare. Il solvente B può essere conservato per un mese a 20-25 °C.
    2. Risospendere le frazioni peptidiche essiccate in acido formico allo 0,1% (v/v) a una concentrazione di circa 0,2-0,5 μg di peptide/μL e mescolare accuratamente. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 5 minuti, quindi trasferire con cura il surnatante nelle fiale per campioni MS, lasciando circa 0,5 μl per evitare il trasferimento di particelle e detriti indesiderati.
    3. Per ogni campione, iniettare ~0,5-1 μg di peptide totale su una colonna trappola C18-LC e separare i peptidi su una colonna analitica C18-LC a una velocità di flusso costante di 250 nL/min utilizzando un sistema UPHLC collegato allo spettrometro di massa con un gradiente del 2%-30% di solvente B in 100 minuti, 30%-50% B in 18 minuti, 50%-95% B in 1 minuto e 9 minuti al 95% (tutti v/v) B nel solvente A (o in una configurazione altrimenti appropriata).
    4. Rilevare i peptidi con uno spettrometro di massa ad alta risoluzione accoppiato al sistema nanoLC dotato di una sorgente ionica nano-elettrospray e funzionante in modalità di polarità ionica positiva.
    5. Per MS1, utilizzare un intervallo di scansione di acquisizione di m/z 350-1.800, alta risoluzione a 60.000-120.000 FWHM a m/z 200 e una tensione di sorgente di ~2,5 kV. Impostare l'AGC su 3 x 106 ioni con un tempo di accumulo massimo di 50 ms (o altre impostazioni appropriate).
    6. Per MS/MS, selezionare i 20 ioni precursori più abbondanti da ciascuna scansione completa MS1 per la frammentazione utilizzando la modalità DDA che impiega HCD-MS/MS con un NCE fisso del 35% o sceHCD con NCE del 25%, 35% e 45%. È importante fissare il valore m/z più basso a 110 (ad esempio, intervallo di scansione m/z 110 - 1.800) per osservare tutti gli ioni ossonio a bassa massa in ogni spettro di frammenti.
    7. Seleziona i precursori che trasportano più di 2 cariche (Z ≥ 2) per la frammentazione. Acquisizione di spettri (sce)HCD-MS/MS con risoluzione di 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC di 1 x 105 ioni e un tempo di accumulo di 90 ms utilizzando una finestra di isolamento del precursore di ± 1,0 Th. Abilita l'esclusione dinamica di 30 s dopo il singolo isolamento e la frammentazione di un dato ione precursore.
      NOTA: Se l'ETD è disponibile, prendere in considerazione anche l'acquisizione di EThcD-MS/MS di campioni di N-glicopeptidi intatti utilizzando l'attivazione ionica dipendente dal prodotto. Eseguire questo passaggio quando gli ioni glicano ossonio diagnostici (ad es. m/z 138.0545, 204.0867 e 366.1396) sono tra i primi 20 ioni frammento all'interno di ciascuno spettro HCD-MS/MS39. Rilevamento dei frammenti EThcD-MS/MS con risoluzione di 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC di 4 x 105 ioni, tempo di iniezione di 250 ms, HCD NCE del 15% e una larghezza di isolamento del precursore di 1,6 Th.
  5. Analisi dei dati di glicoproteomica LC-MS/MS
    1. Confermare l'arricchimento dei dati grezzi LC-MS/MS con N-glicopeptidi controllando che la maggior parte degli spettri HCD-MS/MS contenga ioni ossonio glicano (ad esempio, m/z 138.0545, 204.0867 e 366.1396) e (per le strategie di etichettatura) presenti una separazione di base degli ioni reporter TMT a bassa massa, un'elevata efficienza di frammentazione negli spettri MS/MS e una larghezza di picco LC stretta e un'elevata precisione MS, risoluzione e rapporto segnale-rumore.
    2. Utilizzando un motore di ricerca (ne sono disponibili diversi; vedi sotto), cerca i dati MS/MS per N-glicopeptidi intatti confrontandoli con un database di proteine/peptidi adatto e mirato al campione oggetto di indagine (ad esempio, ottenuto da un esperimento di de-N-glicoproteomica) o con tutte le proteine umane UniProtKB recensite. Personalizza la ricerca contro la N-glicosilazione dei peptidi cercando peptidi con Asn localizzato in sequone. È importante selezionare un database di N-glicani informato sui glicomicsi, cioè i glicani identificati dai dati dei glicomici nella fase 2, per restringere lo spazio di ricerca ai glicani noti per esistere nei campioni.
      NOTA: Ricerche parallele che utilizzano un ampio database predefinito di N-glicani possono essere prese in considerazione per escludere l'esistenza di ulteriori composizioni di N-glicani nei dati.
    3. Personalizzare le variabili di ricerca rimanenti in base al campione studiato, alle specifiche procedure di manipolazione dei campioni eseguite e alle impostazioni MS impiegate e alla strumentazione utilizzata. Le impostazioni di ricerca comuni per la ricerca di dati N-glicoproteomica includono:
      Tolleranza di massa del precursore e del prodotto: 10 ppm e 20 ppm
      Specificità della proteasi: Completamente specifica e/o semispecifica (N-ragged)
      Scollature mancate consentite: 2
      Modifiche corrette: Cys carbamidometilazione (+57.021 Da)
      Modifiche variabili: Met ossidazione (+15.994 Da) (comune 1)
      Modifiche variabili consentite per peptide: 1 o 2
      Modificazioni dei glicani: database dei glicani informato sui glicomicsi (raro 1)
      Database di esche proteiche e contaminanti: Abilitato
    4. Filtra tutte le ricerche fino a raggiungere il tasso di false scoperte (FDR) dell'<1% a livello di proteina e peptide. Considerare solo gli N-glicopeptidi identificati con elevata confidenza (ad esempio, punteggi PEP 2D < 0,001) ed eseguire l'annotazione/cura manuale dell'output filtrato per ridurre ulteriormente il tasso di identificazione errata di N-glicopeptidi come discusso 36,40,41.
      NOTA: I glicopeptidi con N-glicani sialilati e multi-fucosilati e i glicopeptidi che trasportano altre modifiche variabili oltre ai glicani (ad esempio, ossidazione Met e deamidazione Asn/Gln) sono particolarmente inclini a interpretazioni errate da parte dei motori di ricerca41. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla convalida di tali candidati prima della comunicazione.

Risultati

In questa sezione vengono forniti i risultati rappresentativi del metodo glicoproteomico guidato dai gliomici applicato a un vetrino di tessuto FFPE da un paziente affetto da CRC in stadio II.

Per ottenere un materiale proteico di partenza sufficiente per il protocollo, gli estratti proteici da due vetrini (pile z) sono stati combinati dallo stesso blocco di tessuto FFPE seguendo un protocollo pubblicato ed è stato applicato un approccio di marcatura TMT per ...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
In questo documento protocollare, abbiamo delineato passo dopo passo il metodo glicoproteomico guidato dai glifumetti, che fornisce una visione completa dell'eterogeneità e della dinamica del glicoproteoma nel complesso TME.

Un passaggio fondamentale del protocollo consiste nel garantire una proteolisi completa senza digerire eccessivamente la miscela proteica. Le scissioni non specifiche delle proteine aume...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Il THC è supportato da una borsa di studio del programma internazionale di formazione alla ricerca finanziata dal governo australiano. NB è supportato da borse di studio internazionali per l'eccellenza della ricerca della Macquarie University finanziate dalla Macquarie University. AC è supportato da una borsa di studio del programma di formazione alla ricerca finanziata dal governo australiano. RK è stato supportato dal Cancer Institute of New South Wales (ECF181259). MTA ha ricevuto una borsa di studio dell'Australian Research Council Future Fellowship (FT210100455).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium acetate Sigma AldrichA1542Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%Sigma AldrichA6141Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS gradeSigma Aldrich34851Alternatives available
Bovine fetuinSigma AldrichF3004Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatives available
EthanolSigma AldrichE7023Alternatives available
Formic acid, LC-MS gradeSigma Aldrich00940Alternatives available
Glacial acetic acidSigma AldrichA6283Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatives available
MethanolSigma AldrichM1775Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin PromegaV5113Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS gradeSigma AldrichT7408Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS gradeSigma AldrichT6508Alternatives available
Tools/Materials
C18 disksEmpore66883-U
C8 disksEmpore66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMilliporeIPVH20200Pore size: 0.45 μm 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069Alternatives available
Microcentrifuge adapters The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resinThermo1133903Particle size 30 μm
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind tubes 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatives available
Single hole puncherSwingline74005
SpeedVac concentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resinSupelco57088Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatives available
Temperature-controlled incubatorThermolineE7.30Alternatives available
Ultrasonic bathUnisonicsFXPAlternatives available
ZIC-HILIC resinMerck150455Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns MilliporeZTC18S096Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system AgilentAlternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resinDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System ThermoAlternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column ThermoDiscontinuedParticle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U). 
LCMS-grade acetonitrileLiChrosolv100029Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics) ThermoAlternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)ThermoOther high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mLThermoTHC11093563Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching capsThermoTHC09150869Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 or higherCommercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 or higherCommercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoModExpasyOpen access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeatVAST Scientificv2.1Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 or higherOpen access software for relative quantitation of glycans
XcaliburThermov2.2 or higherFor browsing raw LC-MS/MS data

Riferimenti

  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. . Essentials of glycobiology. , 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024 (2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12 (2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48 (2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. . Essentials of glycobiology. , 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. . Essentials of glycobiology. , 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179 (2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516 (2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139 (2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216 (2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026 (2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272 (2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586 (2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037 (2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740 (2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054 (2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25 (2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238 (2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057 (2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822 (2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030 (2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144 (2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120 (2023).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Ricerca sul cancroNumero 216

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati