グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします

要約

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。

要約

グリコシル化は、一般的で構造的に多様なタンパク質修飾であり、広範囲の腫瘍形成プロセスに影響を与えます。質量分析によるグライコミクスとグライコプロテオミクスは、遊離した糖鎖とインタクトグリコペプチドをそれぞれ分析するための強力なアプローチとして登場し、腫瘍微小環境(TME)の不均一なグリコプロテオームをより深く理解するようになりました。このプロトコールでは、統合オミクス技術であるグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法を詳述しており、まず多孔質グラファイトカーボン-LC-MS/MS ベースのグライコミクスを用いて、研究対象の腫瘍組織、細胞集団、または体液のグラコームにおける糖鎖構造とその定量的分布を解明します。これにより、比較グライコミクス解析により、患者グループ、疾患病期、または病態全体でグリコシル化の変化を特定できるだけでなく、重要なことに、既知の糖鎖構造のライブラリを作成することで、同じサンプルの下流のグリコプロテオミクス解析を強化することができ、データ検索時間と糖タンパク質の誤同定率を減らすことができます。このプロトコルでは、N-グリコプロテオームプロファイリングに焦点を当て、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法のサンプル調製ステップを詳しく説明し、データ収集と分析の主要な側面について説明します。グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、TMEに存在する糖タンパク質とそのグリコシル化部位、部位占有率、および部位特異的な糖鎖構造に関する定量的情報を提供します。代表的な結果は、結腸直腸癌患者のホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織から提示されており、この方法が感度が高く、バイオバンクで一般的に見られる組織切片に適合していることを示しています。したがって、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑なTMEにおけるグリコプロテオームの不均一性とダイナミクスを包括的に把握し、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な堅牢な生化学的データを生成します。

概要

タンパク質のグリコシル化は^、生命の系統樹^1,2,3の種によって産生されるタンパク質の共翻訳後修飾の一般的で複雑なタイプです。タンパク質結合型糖鎖は、細胞間相互作用やコミュニケーションイベントの媒介や調節など、ヒトの健康に重要な幅広い生物学的プロセスに影響を与えることが知られています^4,5。タンパク質の糖鎖修飾の異常は、悪性形質転換、腫瘍の進行、および広がりの原因であると考えられています^6,7,8。このことは、腫瘍微小環境(TME)における主要な腫瘍形成プロセスに糖鎖が関与していることを意味し、糖鎖ベースのバイオマーカーの発見や治療応用において、大きく未開拓の可能性を秘めています。したがって、糖鎖生物学は、癌研究および生命科学全体でますます注目を集めています⁹。

過去

プロトコル

この研究は、オーストラリアのシドニーにあるマッコーリー大学の人間研究倫理委員会(医学)によって承認されました(プロトコル5201800073)。

注:グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、糖タンパク質の複雑さが低いものから極端なものまで、さまざまな生体サンプルに適用できます。ラベルフリーのグリコプロテオミクスアプローチ(サンプルプーリングを行わない)では、ペプチド集団の1%〜10%しか構成しない可能性のある糖ペプチドの濃縮後に高いグリコプロテオームカバレッジを確保するために、出発物質として複雑な混合物から約100〜200 μgの総タンパク質が必要です。スペースの制約により、細胞または組織からの最初のタンパク質抽出は省略され、読者は他のリソース¹⁵を参照される。グライコミクスは、ディープグリコームプロファイリングのために分析ごとに 10 ~ 20 μg のタンパク質を控えめに消費し、タンパク質抽出物の大部分をグライコプロテオミクスに残します。特に明記されていない場合は、最終濃度が言及されており、以下のプロトコルで化学薬品を超高品位水に溶解して水溶液を作る必要があります。

1. タンパク質の調製

1. 確立された方法(ビシンコニン酸やBradfor....

結果

このセクションでは、ステージIIのCRCに罹患している患者のFFPE組織スライドに適用されたグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の代表的な結果を示します。

プロトコールに十分なタンパク質出発物質を達成するために、2つのスライド(zスタック)からのタンパク質抽出物を、公開されたプロトコールに従って同じFFPE組織ブロックか?.......

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
このプロトコール論文では、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法を段階的に概説し、複合体TMEにおけるグリコプロテオームの不均一性とダイナミクスを包括的に把握しています。

プロトコールの重要なステップは、タンパク質混合物を過剰に消化することなく、完全なタンパク質分解?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	A1542	Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%	Sigma Aldrich	A6141	Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Sigma Aldrich	34851	Alternatives available
Bovine fetuin	Sigma Aldrich	F3004	Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632	Alternatives available
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Alternatives available
Formic acid, LC-MS grade	Sigma Aldrich	00940	Alternatives available
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	A6283	Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149	Alternatives available
Methanol	Sigma Aldrich	M1775	Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)	Promega	V4831	Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)	Sigma Aldrich	PVP40	Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	484016	Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin	Promega	V5113	Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma Aldrich	213462	Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T7408	Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T6508	Alternatives available
Tools/Materials
C18 disks	Empore	66883-U
C8 disks	Empore	66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate	Corning	3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH20200	Pore size: 0.45 μm
Microcentrifuge	Eppendorf	5452000069	Alternatives available
Microcentrifuge adapters	The Nest Group, Inc., MA	SS18V	MiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resin	Thermo	1133903	Particle size 30 μm
Parafilm	Parafilm M	PM996
Protein LoBind tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030120094
Shaker	Eppendorf	5382000066	Alternatives available
Single hole puncher	Swingline	74005
SpeedVac concentrator	Martin Christ	RVC 2-25 CDplus	Alternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resin	Supelco	57088	Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mL	Sigma Aldrich	Z116866	Alternatives available
Temperature-controlled incubator	Thermoline	E7.30	Alternatives available
Ultrasonic bath	Unisonics	FXP	Alternatives available
ZIC-HILIC resin	Merck	150455	Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns	Millipore	ZTC18S096	Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system	Agilent		Alternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r13.aq.s2570	Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System	Thermo		Alternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column	Thermo	Discontinued	Particle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U).
LCMS-grade acetonitrile	LiChrosolv	100029	Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics)	Thermo		Alternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)	Thermo		Other high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mL	Thermo	THC11093563	Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching caps	Thermo	THC09150869	Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r15.aq.s0202	Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available.
Software
Byonic	Protein Metrics Inc	v2.6.46 or higher	Commercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
Byos	Protein Metrics Inc	v3.9-7 or higher	Commercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoMod	Expasy		Open access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBench	EUROCarbDB	v2.1	Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeat	VAST Scientific	v2.1	Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
Skyline	Brendan X. MacLean	v21.2 or higher	Open access software for relative quantitation of glycans
Xcalibur	Thermo	v2.2 or higher	For browsing raw LC-MS/MS data