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要約

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。

要約

グリコシル化は、一般的で構造的に多様なタンパク質修飾であり、広範囲の腫瘍形成プロセスに影響を与えます。質量分析によるグライコミクスとグライコプロテオミクスは、遊離した糖鎖とインタクトグリコペプチドをそれぞれ分析するための強力なアプローチとして登場し、腫瘍微小環境(TME)の不均一なグリコプロテオームをより深く理解するようになりました。このプロトコールでは、統合オミクス技術であるグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法を詳述しており、まず多孔質グラファイトカーボン-LC-MS/MS ベースのグライコミクスを用いて、研究対象の腫瘍組織、細胞集団、または体液のグラコームにおける糖鎖構造とその定量的分布を解明します。これにより、比較グライコミクス解析により、患者グループ、疾患病期、または病態全体でグリコシル化の変化を特定できるだけでなく、重要なことに、既知の糖鎖構造のライブラリを作成することで、同じサンプルの下流のグリコプロテオミクス解析を強化することができ、データ検索時間と糖タンパク質の誤同定率を減らすことができます。このプロトコルでは、N-グリコプロテオームプロファイリングに焦点を当て、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法のサンプル調製ステップを詳しく説明し、データ収集と分析の主要な側面について説明します。グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、TMEに存在する糖タンパク質とそのグリコシル化部位、部位占有率、および部位特異的な糖鎖構造に関する定量的情報を提供します。代表的な結果は、結腸直腸癌患者のホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織から提示されており、この方法が感度が高く、バイオバンクで一般的に見られる組織切片に適合していることを示しています。したがって、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑なTMEにおけるグリコプロテオームの不均一性とダイナミクスを包括的に把握し、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な堅牢な生化学的データを生成します。

概要

タンパク質のグリコシル化は、生命の系統樹1,2,3の種によって産生されるタンパク質の共翻訳後修飾の一般的で複雑なタイプです。タンパク質結合型糖鎖は、細胞間相互作用やコミュニケーションイベントの媒介や調節など、ヒトの健康に重要な幅広い生物学的プロセスに影響を与えることが知られています4,5。タンパク質の糖鎖修飾の異常は、悪性形質転換、腫瘍の進行、および広がりの原因であると考えられています6,7,8。このことは、腫瘍微小環境(TME)における主要な腫瘍形成プロセスに糖鎖が関与していることを意味し、糖鎖ベースのバイオマーカーの発見や治療応用において、大きく未開拓の可能性を秘めています。したがって、糖鎖生物学は、癌研究および生命科学全体でますます注目を集めています9。

過去10 年、11、12、13、14、15、16、17 年にわたる糖分析とインフォマティクスの主要な開発により、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によるグライコミクスとグライコプロテオミクスは、糖鎖の複雑な混合物から遊離した糖鎖とインタクト糖ペプチドをシステム全体でプロファイリングするための強力なツールとして確立されています。さまざまな種類のがん患者標本(腫瘍組織、細胞集団、体液など)3,13,18,19,20などの生物学的サンプル起源から直接抽出された糖タンパク質。

グライコミクスは、細胞、組織、さらには生物全体によって動的に生成される糖鎖レパートリー(グライコン)の構造と量に関する情報を提供します。一方、グライコプロテオミクスは、タンパク質キャリアとそのグリコシル化部位、部位占有率(マクロ不均一性)、部位特異的な糖鎖組成とその部位分布パターン(ミクロ不均一性)に関する定量的情報を提供しますが、糖鎖構造情報は限られています(多くの場合、糖鎖組成に限定されます)15,16,21.したがって、グライコミクスとグライコプロテオミクスは、グリコプロテオームの生化学的詳細を調査するための補完的なアプローチです22。

グライコミクスおよびグライコプロテオミクスの無数の方法論的デザインと分析戦略が開発され、目的の糖鎖分析物(例:N-/O-/C結合、糖鎖/糖ペプチド/糖タンパク質、標識/非標識)、サンプルの性質(例:細胞、組織、体液)、量(ナノグラム/マイクログラム/ミリグラムのタンパク質レベル)、および利用可能な分析機器に応じて、ラボ間で適用されています23。24、25、26、27、28、29、30、31、32。グライコミクスとグライコプロテオミクスは、並行して使用することで得られる利点が認められているにもかかわらず、分析の専門知識や専門的な機器に対する需要が高いため、糖鎖生物学やがんの研究において単独で適用されることはなく、単独でのアプローチとして使用されています。

この技術ギャップを認識し、10年以上前に、グライコミクスと複雑な生体試料から得られたグライコプロテオミクスデータを統合できるグライコミクス支援グライコプロテオミクス法を導入しました33。要するに、グライコミクス支援(またはこのプロトコルのようにグライコミクスガイド)のグリコプロテオミクス技術は、確立された多孔質グラファイトカーボン(PGC)LC-MS/MS法34,35を通じてN型および/またはO型糖鎖をプロファイリングし、次いで、糖鎖探索空間36の境界を定義することにより、同じサンプルから取得したインタクトNおよび/またはO糖ペプチドデータの分析に使用される.PGC-LC-MS/MSは、高感度かつ構造分解能でグライコームを定量的に把握し、複雑な混合物内でも糖鎖のトポロジー(単糖配列と分岐パターン)とグリコシド結合に関する情報を得ることができるため、特に強力なグライコミクス法です35,37,38.グライコプロテオミクスのワークフローには、ペプチドの生成、オプションのペプチド標識、マルチプレックス、プリフラクショニング、および逆相 LC-MS/MS 分析前の濃縮が含まれます。これは、分析種の同定のためのステップコリジョンエネルギー/高エネルギー衝突解離(sceHCD、N-糖ペプチド用)や電子移動/高エネルギー衝突解離(EThcD、O-糖ペプチド用)など、さまざまなフラグメンテーション法を理想的に採用しています。N-グリコプロテオーム分析では、パラレルde-N-グリコプロテオミクスは、タンパク質/ペプチドの検索空間を定義し、占有されているN-グリコシル化部位とその占有率に関する詳細を提供することにより、インタクトN-グリコペプチドデータ解析を導くことができます。一方、非修飾ペプチドのパラレル分析では、研究条件間のタンパク質レベルの変化が明らかになります。

このホワイトペーパーでは、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の詳細でわかりやすいステップバイステップのプロトコールを提供します(ワークフローの概要については 図1 を参照)。このプロトコールは、サンプル調製ステップと LC-MS/MS ベースのグライコミクスおよびグライコプロテオミクス実験の実験詳細を提供し、大腸がん(CRC)患者から切除された腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片へのこのメソッドの適用を示す代表的な結果を提示し、世界中のがんバイオバンクにアーカイブされている貴重なサンプルタイプで TME の糖鎖生物学に関する洞察を可能にします。グライコミクスとグライコプロテオミクスデータの分析と統合についても簡単に説明します。

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図1:グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の概要。 この概要は、グライコミクス(左)とグライコプロテオミクス(右)のワークフローにおける詳細な実験ステップを示しており、得られた情報の概要(太字)と、データ解析と解釈の改善を通じて2つのアプローチがどのように統合されているかを示しています。インサート:(i)グライコミクスおよび(ii-iii)グリコプロテオミクスのワークフローに使用される自家製SPEマイクロカラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この研究は、オーストラリアのシドニーにあるマッコーリー大学の人間研究倫理委員会(医学)によって承認されました(プロトコル5201800073)。

注:グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、糖タンパク質の複雑さが低いものから極端なものまで、さまざまな生体サンプルに適用できます。ラベルフリーのグリコプロテオミクスアプローチ(サンプルプーリングを行わない)では、ペプチド集団の1%〜10%しか構成しない可能性のある糖ペプチドの濃縮後に高いグリコプロテオームカバレッジを確保するために、出発物質として複雑な混合物から約100〜200 μgの総タンパク質が必要です。スペースの制約により、細胞または組織からの最初のタンパク質抽出は省略され、読者は他のリソース15を参照される。グライコミクスは、ディープグリコームプロファイリングのために分析ごとに 10 ~ 20 μg のタンパク質を控えめに消費し、タンパク質抽出物の大部分をグライコプロテオミクスに残します。特に明記されていない場合は、最終濃度が言及されており、以下のプロトコルで化学薬品を超高品位水に溶解して水溶液を作る必要があります。

1. タンパク質の調製

  1. 確立された方法(ビシンコニン酸やBradfordタンパク質アッセイなど)を使用して、抽出物のタンパク質濃度を測定します。タンパク質濃度を50 mM TEAB(pH 8.5)で10 μg/μLに調整します。
  2. サンプルを10 mM DTTで56°C、45分間インキュベートすることにより、ジスルフィド結合を減少させます。 その後、サンプルを40 mM IAAと暗所で20〜25°Cで30分間インキュベートすることにより、アルキルフリーのチオール基をインキュベートします。 過剰なDTT(~40 mM)でアルキル化反応をクエンチします。
  3. 各タンパク質サンプルを分割します。グライコミクスには約10〜20 μgの総タンパク質を、グライコプロテオミクスワークフローには100〜200 μgの総タンパク質を許容します。
    注:目的のタンパク質サンプルに加えて、既知のモデル糖タンパク質(ウシフェチュインなど)またはタンパク質混合物(細胞株ライセート、血漿など)を含めて、手順の効率と再現性を評価し、LC-MS/MSの性能をモニターします。

2. N-グライコミクスワークフロー

  1. PVDFメンブレン上のタンパク質の固定化
    1. シングルホールパンチャーを使用して、スポットするタンパク質サンプルの数でPVDFメンブレンフィッティングをカットします。
    2. 切除したメンブレンをエタノールまたはメタノールで濡らし、メンブレンを平底の96ウェルプレートに移します。
    3. メンブレンがほぼ乾いたら、タンパク質サンプルを最大容量2.5 μL/スポットに堆積させて、堆積したタンパク質サンプルの表面積を最小限に抑えます。必要に応じてサンプルを再スポットし、スポット上の固定化タンパク質の総量が10~20μgになるようにします。これを行うには、スポット手順を繰り返す前にスポットを自然乾燥させます。
      注:スポッティング中は、メンブレンが乾燥して完成するのを防ぐために、メンブレンをエタノールまたはメタノールで再度濡らす必要がある場合があります。
    4. メンブレンを20〜25°Cで少なくとも3時間、できれば一晩風乾します。乾燥中のメンブレンの汚染を避けてください。
      注:任意の品質管理ステップとして、メンブレン上に発見されたタンパク質は、前述のようにDirect Blue 71溶液で染色することにより可視化することができる34。
  2. タンパク質結合型N型糖鎖の放出
    1. 100 μLのメタノール溶液PVP40を、スポットメンブレンを含む各ウェルに添加します。タンパク質サンプルがスポットされたメンブレンの側が、サンプル調製全体を通して上を向いていることを確認してください。
    2. PVP40溶液でプレートを20〜25°Cで5分間振とうし、PVP40溶液を廃棄します。
      注:PVP40溶液は、PVDF膜とウェルをブロックして、後続のステップでPNGase F(および並行実験で連鎖特異的情報を達成するために適用できる可能性のあるエキソグリコシダーゼ;以下の説明を参照)の非特異的結合を防ぎます。
    3. ブロックされたタンパク質スポットを含む各ウェルを100μLの超純水で洗浄し、プレートを5分間振とうします。この手順を3回繰り返します。洗濯のたびに水が完全に捨てられていることを確認してください。
    4. 15 μLのPNGase F溶液(0.5 U/μL、10 U/μLストック溶液の超純水で希釈)を各ウェルに加えます(サンプルあたり15 μgのタンパク質が沈殿したと仮定します)。
    5. インキュベーションの後続のステップでサンプルが脱水するのを防ぐために、周囲の空のウェルに水を追加し、透明なフィルムを使用してプレートを慎重に密封します。プレートを37°Cで少なくとも8時間インキュベートします。
    6. プレートを5分間超音波処理して、ウェルの側面に蒸発した液滴がプレートの底に溜まるのを助けます。
    7. 遊離したN型糖鎖サンプルを個々の微量遠心チューブ(1.5 mL)に慎重に移します。サンプルウェルを20μLの超純水で2回洗浄し、分注し、数回吸引します。各ウェルに残ったサンプルを、N-グリカンサンプルが入った微量遠心チューブに結合します。
      注:N-グリコミクスサンプル調製には、親水性糖鎖がコーティングされたチューブに不可逆的に結合する可能性があるため、低結合チューブの使用は避けてください。
    8. 100 mM酢酸アンモニウム(pH 5.0)を10 μL加え、サンプルを20〜25°Cで1時間インキュベートします。
      注:このステップでは、遊離したN-グリカンの還元末端にあるアミノ化 N-アセチルグルコサミン残基をヒドロキシル化し、その後のステップで徹底的な還元を可能にします。100 mM 酢酸アンモニウムは、分離した N 型糖鎖の還元末端におけるグリコシルアミンからヒドロキシルへの高い変換速度が溶液の弱酸性度に依存するため、pH 5.0 に調整します。
    9. N型糖鎖サンプルを真空濃縮装置で乾燥させます。
  3. 遊離N型糖鎖の還元
    1. 調製したばかりの1 M NaBH4 in 50 mM KOHを20 μLを乾燥N-glycanサンプルに加え、十分に混合します。
      注:NaBH4 は、使用日にKOHで新たに調製する必要があります。
    2. 各チューブの蓋をしっかりと閉じ、サンプルを50°Cで3時間インキュベートします。
      注:N 型糖鎖は還元を受け、還元末端の α-アノマーと β-アノマーが 1 つのアルジトール型に変換され、PGC-LC-MS/MS 分析で 1 つのクロマトグラフィーピークが得られます。
    3. インキュベーション後、サンプルチューブを微量遠心分離機で回転させ、液体をチューブの底に運びます。
    4. 各サンプルに100μLの超純水を加えます。2 μL の氷酢酸を添加して、アルカリ性 N 型糖鎖サンプルを中和します。微量遠心分離機でサンプルチューブを回転させ、サンプルをチューブの底に運びます。
      注:氷酢酸はアルカリ性サンプルを中和し、反応中に水素ガス(H2)の形成とその後の発泡を引き起こします。
  4. PGC-C18-SPEを用いたN型糖鎖の脱塩
    1. 以下に説明するように、自家製のPGC-C18-SPEマイクロカラムを調製します。
      1. 適切なシリンジを使用して、C18ディスクを適切なピペットチップ(10μL)に差し込んで移します。
        注:ここでは、市販のC18-SPEマイクロカラムも使用できます。
      2. PGC樹脂の10 μLスラリーを50%(v / v)メタノールに懸濁し、C18-SPEマイクロカラムにピペットで入れます。マイクロカラムを、マイクロ遠心アダプターを取り付けた2 mLチューブに入れます。チューブを回転させて、カラム高さが~0.5 cmのPGC-C18-SPEマイクロカラムを作成します( 図1iを参照)。各サンプルにPGC-C18-SPEマイクロカラムを1本用意します。
        注:アダプターを使用すると、マイクロカラムがチューブの中央に吊り下げられます。
      3. その後の洗浄およびサンプルローディングステップでは、卓上遠心分離機を 6,000 rpm(~2,000 x g)に設定し、60 秒間回転させて、移動相が PGC-C18-SPE マイクロカラムを通過するのを容易にします。各PGC-C18-SPEマイクロカラムをACN中の50 μL 0.1% (v/v) TFAで3回、続いて50 μL 0.1%(v/v) TFAで3回連続して洗浄し、コンディショニングします。
        注:PGC-SPEマイクロカラムは数時間前に調製できますが、使用前に室温で水和させて保存する必要があります。
    2. N 型糖鎖サンプルを最大 40 μL のローディング容量で PGC-C18-SPE マイクロカラムにアプライし、添加するたびに 6,000 rpm(~2,000 x g)で 60 秒間スピンします。ローディングステップを繰り返して、N型糖鎖サンプル全体をマイクロカラムに適用します。
      注:フロースルーフラクションには糖鎖が含まれていてはなりませんが、PGC-C18-SPE マイクロカラムでの不完全な保持が発生した場合にグライコミクスデータが正常に取得されるまで、これらのフラクションを保持することをお勧めします。
    3. PGC-C18-SPE マイクロカラムを 20 μL の超純水で洗浄します。PGC-C18-SPE マイクロカラムを新しい 1.5 mL 微量遠心チューブに移し、N 型糖鎖溶出の準備をします。
    4. 各PGC-C18-SPEマイクロカラムに50%(両方ともv/v)ACN中の0.1%TFAを40μL添加してN型糖鎖を溶出し、その後遠心します。この手順を繰り返して、溶出液を混ぜ合わせます。
      注:各スピン後にマイクロカラムをモニターして、溶液が完全にスピンスルーされたことを確認することが重要です。これにより、効率的な溶出が容易になります。
    5. 脱塩したN型糖鎖を真空濃縮装置で乾燥させます。
  5. PGC-LC-MS/MS取得
    1. 以下に説明するようにLC溶媒を調製します。
      1. 溶媒A:100 mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)原液100 mLを超純水に調製します。真空ろ過ユニットを使用して0.2 μmのナイロンフィルターディスクでストック溶液をろ過し、微粒子を除去します。次に、100 mLの100 mMNH4HCO3原液100 mLを900 mLの超純水で希釈して、1 Lの10 mMNH4HCO3溶液(溶媒A)を調製します。溶媒Aを15分間超音波処理して、溶液を脱気します。溶媒Aは20〜25°Cで1週間保存できますが、100 mM NH4HCO3ストック溶液は4°Cで1か月間保存できます。
      2. 溶媒B:100 mLの100 mLの100 mM NH4HCO3ストック溶液(前のステップ2.5.1.2を参照)を700 mLのACNに加えて、超純水(溶媒B)中の10 mM NH4HCO3を70%(v/v)ACN中に調製し、700 mLのACNに加え、超純水で合計容量1 Lに希釈します。溶媒Bを15分間超音波処理して脱気します。溶媒Bは、20〜25°Cで2週間保存できます。
    2. 脱塩したN型糖鎖を10 μLの超純水に再懸濁し、十分に混合します。サンプルを 14,000 x g で 5 分間遠心した後、上清を MS サンプルバイアルに慎重に移し、約 0.5 μL を残して、LC-MS/MS システムに損傷を与える可能性のある可視または不可視の微粒子や破片が移らないようにします。
    3. HPLC システム上の溶媒 A に 0% から 70% (v/v) の溶媒 B の 60 分間の線形(または適切な)グラジエントを使用して、50 °C に加熱した PGC-LC キャピラリーカラムに N 型糖鎖を注入し、分離します。HPLCシステムが質量分析計に接続され、20 μL/minの一定の流量で動作していることを確認します(PGC-LCカラムの形状に合わせて流量を調整してください)。
    4. エレクトロスプレーイオン源とともに設置され、負イオン極性モードで作動するリニアイオントラップ四重極型質量分析計(または別の適切な低分解能または高分解能MSシステム)を使用して、分離されたN型糖鎖を検出します。
    5. MS1の集録スキャン範囲を m/z 150-2,000に設定し、ズームスキャンのピーク幅を m/z 0.25、 m/z 200の全幅半値(FWHM)に設定します。電源電圧を3.2kVに設定します。MS1スキャンの場合、自動ゲインコントロール(AGC)を5 x 104 イオンに設定し、最大蓄積時間を50 ms(または適切な設定)に設定します。
      注:低い開始 m/z には、N糖鎖とO糖鎖によく寄与する単糖類と二糖類の検出が含まれます。
    6. MS/MSの場合、分解能をm/z 200でm/z 0.25 FWHM、AGCを2 x 104イオン、最大蓄積時間を300 msに設定します。データ依存型取得(DDA)を有効にし、共鳴活性化(イオントラップ)衝突誘起解離(CID)を使用したフラグメンテーションの各MS1フルスキャンで最も豊富な5つのプリカーサーを選択し、正規化された衝突エネルギー(NCE)が33%です。動的排除の選択を解除すると、近接して溶出する同重体N-グリカン異性体を見逃さないようにすることができます。
  6. LC-MS/MS グライコミクスデータのデータ解析
    1. 適切なソフトウェアを使用して生成された LC-MS/MS 生データを閲覧し、狭い LC ピーク幅、効果的な N 型糖鎖異性体の分離、高い MS 精度、分離能、S/N 比、および高い CID-MS/MS フラグメンテーション効率を確認した後、高いデータ品質を確保します。
    2. サンプル中の N 型糖鎖を、モノアイソトピックプリカーサーの質量、CID-MS/MS フラグメンテーションパターン、および相対保持時間および絶対 PGC-LC 保持時間に基づいて手動で同定します。
      注:RawMeat v2.1、GlycoMod、およびGlycoWorkBench v2.1は、説明されている26の識別プロセスを支援することができる。観察された分析種間の既知の生合成制約および構造的関連性も、同定されたN型糖鎖26にさらなる信頼性を追加することができる。あるいは、市販のソフトウェアを使用して、半自動の糖鎖同定とスペクトルアノテーションを行うこともできます。
    3. 相対 N 型糖鎖定量では、同定されたすべての N 型糖鎖異性体のモノアイソトピックプリカーサー m/z を含むトランジションリストを作成し、市販のソフトウェアを使用して、説明されているように、すべての N 型糖鎖プリカーサーイオンの抽出イオンクロマトグラム(EIC)に基づいて曲線下面積(AUC)値を決定します26。

3. N-グリコプロテオミクスのワークフロー

  1. タンパク質混合物の消化
    1. トリプシン(1:50酵素:タンパク質比、w / w)および/または選択した他のプロテアーゼを各サンプルに添加することにより、還元およびアルキル化タンパク質抽出物(パート1から)100〜200μgを消化します。
      注:グライコミクスサンプル調製とは異なり、ペプチド回収率を最大化するために、可能であれば、グリコプロテオミクスサンプル調製ステップには低結合の微量遠心チューブを使用してください。
    2. サンプルを37°Cで8〜12時間インキュベートします。 pHが~8.5であることを確認してください。なぜなら、弱アルカリ性の溶液はトリプシン消化効率を向上させるからです。
      注:予測可能な切断パターンを生成し、トリプシンやLys-CなどのほとんどのN-糖ペプチドに単一のシークオン(グリコシル化部位)を残す特定のプロテアーゼが好ましい。トリプシンや他のプロテアーゼによるタンパク質の非特異的な切断を減らすために、サンプルを過度にインキュベートすることは避けてください。
    3. 1%(v / v)TFAを添加することにより、酸性化(長時間の消化によって引き起こされる非特異的な切断を避けるため)によって消化を停止します。
  2. Oligo R3-C18-SPEを用いたペプチド脱塩
    1. 以下に説明するように、自家製のOligo R3-C18-SPEマイクロカラムを調製します。
      1. 適切なシリンジを使用して、C18ディスクを10 μLピペットチップに差し込んで移します。
        注:ここでは、市販のC18-SPEマイクロカラムも使用できます。
      2. ニートACNに懸濁したOligo R3樹脂のスラリーをC18-SPEマイクロカラムに沈着させます。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプターを取り付けた 2 mL チューブにセットし、マイクロカラムがチューブの中央に懸濁し、遠心してカラム高さが ~1 cm の Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムを作成します( 図 1ii を参照)。各サンプルに1つのOligo R3-C18-SPEマイクロカラムを調製します。
    2. その後の洗浄およびサンプルローディングステップでは、ベンチトップ遠心分離機を 6,000 rpm(~2,000 x g)に調整し、60 秒間回転させて、移動相が Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムを通過させます。各Oligo R3-C18-SPEマイクロカラムを、50 μLのニーACN(3倍)と50 μLの0.1%(v/v)TFA(3倍)で順次洗浄し、コンディショニングします。
      注:Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムは、事前に調製し、使用前に室温で数時間水和して保存することができます。
    3. コンディショニングされたOligo R3-C18-SPEマイクロカラムを、マイクロ遠心アダプターとともに新しい1.5 mLチューブに入れます。トリプシンで消化したペプチド混合物をOligo R3-C18-SPEマイクロカラムに適用し、2,000 x g で60秒間遠心します。50 μLを超えるサンプル量では、複数回のローディングが必要になる場合があります。
    4. Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムを 50 μL の 0.1% (v/v) TFA 3x で洗浄します。Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムを新しい 1.5 mL チューブに移し、脱塩ペプチドの溶出に備えます。
    5. 50 μL の 0.1% TFA を 50% (both v/v) ACN に、続いて 50 μL の 0.1% TFA を 70% (both v/v) ACN に 50 μL を各 Oligo R3-C18-SPE マイクロカラムに適用して、脱塩ペプチドを溶出します。各ステップの後にスピンします。
      注:各スピン後にマイクロカラムをモニターして、溶液が完全にスピンスルーされたことを確認することが重要です。これにより、効率的な溶出が容易になります。
    6. 脱塩したペプチドを真空濃縮装置システムで収集、結合、乾燥します。
      注:プロテオミクスと脱N-グリコプロテオミクスを並行して行う場合(「ディスカッション」を参照)、脱塩したペプチドサンプルを分割し、乾燥前に別々の画分を取っておきます。
  3. ZIC-HILIC-C8-SPEを用いたN-糖ペプチドの濃縮
    1. 以下に説明するように、自家製のZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを準備します。
      1. 適切なシリンジを使用して、C8ディスクを10 μLピペットチップに差し込んで移します。
      2. メタノールに懸濁したZIC-HILIC樹脂のスラリーをC8-SPEマイクロカラムに沈着させます。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプターを取り付けた 2 mL チューブにセットして、マイクロカラムがチューブの中央に懸濁し、回転してカラム高さが ~1 cm の ZIC-HILIC-C8-SPE マイクロカラムを作成します( 図 1iii を参照)。各サンプルに1つのZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを準備します。
    2. その後の洗浄およびサンプルローディングステップでは、ベンチトップ遠心分離機を 6,000 rpm(~2,000 x g) に調整し、60 秒間回転させて、移動相が ZIC-HILIC-C8-SPE マイクロカラムを通過させます。各ZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを、50 μLのメタノール(3倍)、次に50 μLの超純水(3倍)、最後に50 μLの1% TFAを80%(両方ともv/v)ACN(3倍)で順次洗浄し、コンディショニングします。
      注:ZIC-HILIC-C8-SPE マイクロカラムは数時間前に調製できますが、使用前に室温で水和させて保存する必要があります。
    3. N-糖ペプチド濃縮用に指定された乾燥ペプチド混合物を、80%(両方v/v)ACN中の1% TFAの50 μLに再懸濁し、十分に混合します。
      注:ペプチドをHILICローディング溶媒に再溶解するのが難しい場合は、まずペプチドを10%(v/v)TFAに再溶解し、次にACNで迅速に希釈して、HILICローディング溶媒の濃度に到達させることができます。高TFA濃度では、加水分解の誘発を避けるために、サンプルの加熱を避けてください。
    4. コンディショニングされたZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを、マイクロ遠心アダプターとともに新しい1.5 mLチューブに入れます。再懸濁したペプチド混合物をZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムに適用し、2,000 x g で60秒間遠心します。50 μLを超えるサンプル量では、複数回のローディングが必要になる場合があります。
    5. フロースルーフラクションを回収し、同じZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムにフラクションを再度塗布します。再塗布を2回繰り返し、フロースルーチューブを保持します。
    6. ZIC-HILIC-C8-SPE マイクロカラムを 1% TFA 50 μL の 80% (両方 v/v) ACN 溶液で 2 回洗浄し、遠心処理し、このフロースルーをステップ 3.3.4 のフロースルーと組み合わせます。
      注:組み合わせたフロースルー画分には、通常、全ペプチド材料の~90%が含まれており、非修飾ペプチド画分を効果的に形成するため、(個別のプロテオミクスタイプの実験を行うのではなく)別々のダウンストリーム分析に使用できます。
    7. ZIC-HILIC-C8-SPE マイクロカラムを新しい 1.5 mL 低結合マイクロ遠心チューブに移します。保持されたN-糖ペプチドを50 μLの0.1%(v/v)TFAで順次溶出し、続いて50 μLの25 mM重炭酸アンモニウム、50 μLの50 μLの50%(v/v)ACNで溶出します。各ステップの後、2,000 x g で60秒間回転します。
      注:溶出液には通常、全ペプチド材料の~10%が含まれており、高い濃縮効率が達成される場合、そのほとんどはN-糖ペプチドであるはずです。各スピン後にマイクロカラムをモニターして、溶液が完全にスピンスルーされていることを確認することが重要です。これにより、効率的な溶出が容易になります。
    8. 濃縮されたN-グリコペプチドを収集、結合、乾燥し、(必要に応じて)真空濃縮システム内のフラクションを通る非修飾ペプチドの流れを行います。
  4. インタクト N-糖ペプチドの逆相 LC-MS/MS
    1. 以下に説明するようにLC溶媒を調製します。
      1. 溶媒A:超純水に0.1%(v / v)ギ酸1Lを調製します。15分間超音波処理して溶媒を脱気します。溶媒Aは、20〜25°Cで1ヶ月間保存できます。
      2. 溶媒B:99.9%(両方v / v)ACN中の0.1%ギ酸1Lを調製します。15分間超音波処理して脱気します。溶媒Bは、20〜25°Cで1ヶ月間保存できます。
    2. 乾燥ペプチド画分を0.1%(v / v)ギ酸に再懸濁して約0.2〜0.5μgペプチド/μLの濃度に戻し、十分に混合します。サンプルを 14,000 x g で 5 分間遠心し、上清を MS サンプルバイアルに慎重に移し、約 0.5 μL を残して、不要な微粒子や破片が移動しないようにします。
    3. 各サンプルについて、C18-LC トラップカラムに合計 ~0.5-1 μg のペプチドを注入し、質量分析計に接続された UPHLC システムを使用して 250 nL/min の一定流速で C18-LC 分析カラムにペプチドを分離し、溶媒 B を 2%-30% 溶媒 B で 100 分間、B を 30%-50% B で 18 分間グラジエントします。 溶媒A(またはそれ以外の適切なセットアップ)で95%(all v / v)Bで1分間、および9分間で50%-95%B。
    4. ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたnanoLCシステムと組み合わせて、正イオン極性モードで動作する高分解能質量分析計でペプチドを検出します。
    5. MS1の場合、 m/z 350-1,800のアクイジションスキャン範囲、 m/z 200で60,000-120,000 FWHMの高分解能、~2.5kVのソース電圧を使用します。AGCを3 x 106 イオンに最大蓄積時間50 ms(または適切な設定)で設定します。
    6. MS/MS では、各 MS1 フルスキャンから最も存在量の多い 20 種類のプリカーサーイオンを選択し、HCD-MS/MS の固定 NCE が 35% の HCD-MS/MS または NCE が 25%、35%、45% の sceHCD を使用した DDA モードを使用したフラグメンテーションを行います。重要なのは、 m/z の下限値を110(スキャン範囲m /z 110 - 1,800など)に固定して、各フラグメントスペクトルの低質量オキソニウムイオンをすべて観察することです。
    7. フラグメンテーションのために2つ以上の電荷(Z≥2)を持つ前駆体を選択します。 m/z 200 で 30,000-45,000 FWHM の分解能で 30,000-45,000 FWHM の分解能で (sce)HCD-MS/MS スペクトルを 1 x 10 の5 イオン、±90 ミリ秒の蓄積時間で取得します。プリカーサー単離ウィンドウ 1.0 Th.
      注:ETD が利用可能な場合は、製品依存性イオントリガーを使用して、インタクト N-糖ペプチドサンプルの EThcD-MS/MS も取得することを検討してください。診断用糖鎖オキソニウムイオン( m/z 138.0545、204.0867、366.1396など)が各HCD-MS/MSスペクトル内の上位20のフラグメントイオンに含まれている場合に、このステップを実行します39。 m/z 200 で 30,000-45,000 FWHM の分解能で EThcD-MS/MS フラグメントを m/z 200 で検出し、AGC は 4 x 105 イオン、注入時間は 250 ms、HCD NCE は 15%、プリカーサー分離幅は 1.6 Th。
  5. LC-MS/MSグライコプロテオミクスデータのデータ解析
    1. ほとんどのHCD-MS/MSスペクトルに糖鎖オキソニウムイオン( m/z 138.0545、204.0867、366.1396など)が含まれていること、および(標識戦略用)低質量TMTレポーターイオンのベースライン分離、MS/MSスペクトルの高いフラグメンテーション効率、狭いLCピーク幅、および高いMS精度を特徴とすることにより、N-糖ペプチドによるLC-MS/MS生データの濃縮を確認します。 分解能と信号対雑音比。
    2. 検索エンジン(複数あり、下記参照)を使用して、調査対象のサンプルを対象とする適切なタンパク質/ペプチドデータベース(例えば、de-N-glycoproteomics実験から得られたもの)またはレビュー済みのすべてのUniProtKBヒトタンパク質に対して、MS/MSデータでインタクトN-糖ペプチドを検索します。ペプチドのN-グリコシル化に対する検索を調整するには、Sequonに局在するAsnを持つペプチドを検索します。重要なことは、グライコミクス情報に基づく N 型糖鎖データベース、つまりステップ 2 のグライコミクスデータから同定された糖鎖を選択し、サンプル中に存在することが知られている糖鎖に検索スペースを限定することです。
      注:広範な事前定義されたN型糖鎖データベースを使用した並行検索は、データ中の追加のN型糖鎖組成の存在を除外するために考慮される場合があります。
    3. 残りの検索変数は、研究対象のサンプル、実施する特定のサンプル取り扱い手順、および使用したMS設定と使用した装置に応じて調整します。N-グリコプロテオミクスデータ検索の一般的な検索設定には、以下のものがあります。
      前駆体および製品の質量許容範囲:10ppmおよび20ppm
      プロテアーゼ特異性:完全特異的および/または半特異的(N-ラギッド)
      許容される劈開の見逃し:2
      固定修飾:Cysカルバミドメチル化(+57.021 Da)
      変数修飾:メット酸化(+15.994 Da)(共通1)
      ペプチドごとに許容される可変修飾:1または2
      糖鎖修飾:Glycomics-informed glycan database (rare 1)
      タンパク質デコイおよび汚染物質データベース:有効
    4. すべての検索を、タンパク質レベルおよびペプチドレベルで<1%の偽発見率(FDR)でフィルタリングします。高い信頼性で同定されたN-糖ペプチドのみを考慮し(例:PEP 2Dスコア<0.001)、フィルタリングされた出力の手動アノテーション/キュレーションを実行して、36,40,41で説明したように、誤ったN-糖ペプチド同定の割合をさらに減らします。
      注:シアル化およびマルチフコシル化N-グリカンを有する糖ペプチド、および糖鎖に加えて他の可変修飾を有する糖ペプチド(すなわち、Met酸化およびAsn/Gln脱アミド化)は、検索エンジン41によって特に誤解されやすい。報告前にそのような候補者を検証するために特に注意を払う必要があります。

結果

このセクションでは、ステージIIのCRCに罹患している患者のFFPE組織スライドに適用されたグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の代表的な結果を示します。

プロトコールに十分なタンパク質出発物質を達成するために、2つのスライド(zスタック)からのタンパク質抽出物を、公開されたプロトコールに従って同じFFPE組織ブロックか?...

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
このプロトコール論文では、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法を段階的に概説し、複合体TMEにおけるグリコプロテオームの不均一性とダイナミクスを包括的に把握しています。

プロトコールの重要なステップは、タンパク質混合物を過剰に消化することなく、完全なタンパク質分解?...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

THCは、オーストラリア政府が資金提供する国際研究研修プログラム奨学金によって支えられています。NBは、マッコーリー大学が資金提供する国際マッコーリー大学リサーチエクセレンス奨学金によってサポートされています。ACは、オーストラリア政府が資金提供する研究研修プログラムの奨学金によって支えられています。RKは、ニューサウスウェールズがん研究所(ECF181259)の支援を受けました。MTAは、オーストラリア研究評議会のフューチャーフェローシップ(FT210100455)を受賞しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium acetate Sigma AldrichA1542Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%Sigma AldrichA6141Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS gradeSigma Aldrich34851Alternatives available
Bovine fetuinSigma AldrichF3004Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatives available
EthanolSigma AldrichE7023Alternatives available
Formic acid, LC-MS gradeSigma Aldrich00940Alternatives available
Glacial acetic acidSigma AldrichA6283Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatives available
MethanolSigma AldrichM1775Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli 
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin PromegaV5113Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS gradeSigma AldrichT7408Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS gradeSigma AldrichT6508Alternatives available
Tools/Materials
C18 disksEmpore66883-U
C8 disksEmpore66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMilliporeIPVH20200Pore size: 0.45 μm 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069Alternatives available
Microcentrifuge adapters The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resinThermo1133903Particle size 30 μm
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind tubes 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatives available
Single hole puncherSwingline74005
SpeedVac concentratorMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resinSupelco57088Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatives available
Temperature-controlled incubatorThermolineE7.30Alternatives available
Ultrasonic bathUnisonicsFXPAlternatives available
ZIC-HILIC resinMerck150455Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns MilliporeZTC18S096Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system AgilentAlternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resinDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System ThermoAlternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column ThermoDiscontinuedParticle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U). 
LCMS-grade acetonitrileLiChrosolv100029Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics) ThermoAlternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)ThermoOther high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mLThermoTHC11093563Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching capsThermoTHC09150869Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 or higherCommercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 or higherCommercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoModExpasyOpen access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeatVAST Scientificv2.1Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 or higherOpen access software for relative quantitation of glycans
XcaliburThermov2.2 or higherFor browsing raw LC-MS/MS data

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