Evaluación del salidrósido como agente terapéutico para la calcificación vascular mediante farmacología de redes y modelos experimentales de ratas

Resumen

Este estudio establece un modelo de calcificación vascular en ratas inducida por una dieta alta en grasas (HFD) combinada con vitamina D3 (VD3). El modelo se utilizó para evaluar la eficacia terapéutica del salidrósido en la prevención y el tratamiento de la calcificación vascular, proporcionando información sobre sus posibles mecanismos de acción a través de la farmacología en red y experimentos in vivo .

Resumen

La calcificación vascular (VC) es una condición patológica crítica asociada con una morbilidad y mortalidad significativas. Este estudio emplea un enfoque híbrido de farmacología de redes y biología molecular para delinear los mecanismos terapéuticos del salidrósido (SAL), un compuesto activo de Rhodiola crenulata, contra el VC. A través de la minería de bases de datos y el análisis de redes, se identificaron 388 objetivos SAL que se cruzan con 2871 objetivos asociados a VC, lo que dio como resultado 208 objetivos comunes. Una red de interacción proteína-proteína (PPI) construida a través de la base de datos String y el análisis topológico en Cytoscape 3.9.1 identificó 10 objetivos clave, incluidos IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 y STAT3, entre otros. Los genes identificados se concentraron en las vías lipídica y de aterosclerosis, lo que indica que la mejora de la VC por SAL puede ocurrir a través de la regulación de la expresión anormal de factores lipídicos e inflamatorios. También se encontró que la SAL inhibe la expresión anormal de factores inflamatorios, activando así la vía JAK2/STAT3 para intervenir en la progresión de la VC. La vía JAK2/STAT3 es un mecanismo molecular clave por el cual SAL previene un mayor deterioro de la VC. Los análisis de enriquecimiento funcional revelaron la implicación de estas dianas en las respuestas inflamatorias y el metabolismo de los lípidos, vías fundamentales en la VC. Los estudios in vivo en ratas demostraron la eficacia de SAL en la mitigación de la dislipidemia y la inflamación vascular, con perfiles lipídicos séricos mejorados y una reducción de la deposición vascular de calcio. La exploración mecanicista, basada en el análisis de Western blot, demostró la capacidad del salidrósido para regular la vía de señalización JAK2/STAT3, destacando su potencial como modulador en este mecanismo molecular crítico y ofreciendo un objetivo terapéutico potencial para la VC. La fortaleza de esta investigación radica en su rigor metodológico, integrando predicciones computacionales con validaciones in vivo . Este enfoque integral establece un marco sólido para explorar los mecanismos terapéuticos de los compuestos naturales en la lucha contra la VC.

Introducción

La calcificación vascular (VC) se refiere a la deposición anormal de calcio dentro de las paredes de los vasos, lo que conduce a un endurecimiento arterial y una disminución de la elasticidad, lo que en última instancia perjudica la función vascular. Tradicionalmente, la VC se ha dividido en dos tipos: calcificación intimal, relacionada con la acumulación de lípidos, y calcificación medial. El primero está estrechamente asociado con la infiltración inflamatoria, desencadenando una transformación osteogénica en la pared vascular, caracterizada por la migración, proliferación y diferenciación de células del músculo liso vascular (CMV) en células similares a los osteoblastos¹.

La capacidad de las VSMC para experimentar una diferenciación osteogénica, influenciada por factores como el envejecimiento, la genética y las condiciones ambientales como la diabetes y la enfermedad renal crónica, es un factor importante que contribuye a la VC relacionada con la edad. Esta transformación osteoblástica exacerba la calcificación arterial y la degeneración¹.

La VC es una afección multifacética, impulsada por cambios degenerativos, desequilibrios metabólicos y diversas afecciones sistémicas. Aproximadamente el 80% de las lesiones vasculares y el 90% de los casos de enfermedad arterial coronaria presentan VC, lo que aumenta significativamente el riesgo de eventos cardiovasculares graves ^1,2. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de descubrir tratamientos farmacológicos que mitiguen o reviertan eficazmente esta afección.

En la actualidad, las estrategias de tratamiento de la CV implican diversas intervenciones farmacológicas, aunque no hay fármacos diseñados específicamente para este fin. Para los pacientes con calcificación leve, a menudo se recetan estatinas para estabilizar las placas. Sin embargo, si bien pueden reducir la estenosis de las arterias coronarias al disminuir los niveles de lípidos, su efecto sobre la calcificación es limitado².

Dadas las complejidades de la aterosclerosis, muchos pacientes presentan una mayor activación plaquetaria, lo que requiere el uso de fármacos antiplaquetarios como la aspirina o el clopidogrel para inhibir la agregación plaquetaria y reducir el riesgo de trombosis. Sin embargo, la terapia con aspirina solo es beneficiosa para las personas con una puntuación alta de calcio en las arterias coronarias y un bajo riesgo de sangrado³.

Además, la investigación sobre suplementos, como la vitamina K, sugiere potencial en la prevención de la progresión de la VC⁴. En casos graves, se pueden considerar intervenciones invasivas, aunque a menudo no son adecuadas para la VC⁵ generalizada. Para las personas sin VC, el manejo de los factores de riesgo, como la presión arterial, los perfiles lipídicos y las opciones de estilo de vida, sigue siendo fundamental⁶.

La Rhodiola crenulata, una hierba perenne de la familia Crassulaceae, se ha utilizado tradicionalmente en la medicina china. Su principal constituyente bioactivo, el salidrósido, merece una atención significativa debido a sus notables actividades biológicas. El salidrósido es conocido por su capacidad para inhibir la apoptosis, exhibir sólidas propiedades antioxidantes y poseer características antiinflamatorias ^7,8. Estos atributos contribuyen a su potencial para mejorar la función vascular, retrasar el envejecimiento vascular y salvaguardar el endotelio vascular. Como agente terapéutico potencial para la VC, el salidrósido tiene un valor sustancial para la investigación. Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales el salidrósido mejora la VC aún no se han dilucidado por completo y justifican una mayor investigación para aprovechar su potencial terapéutico en el tratamiento de la VC.

Para explorar estos mecanismos, este estudio aprovecha la farmacología de redes, una metodología innovadora que combina la farmacología, la bioinformática y la informática para analizar sistemas biológicos y dilucidar los mecanismos de los fármacos. En comparación con la investigación tradicional de fármacos de un solo objetivo, la farmacología en red ofrece un enfoque más completo mediante el análisis de los efectos de un fármaco en múltiples dianas biológicas y vías de señalización. Como herramienta clave en el desarrollo moderno de fármacos, construye redes de fármacos, dianas y vías para revelar los mecanismos subyacentes de la acción de los fármacos ^9,10. A pesar de su amplio uso en la exploración de mecanismos terapéuticos, ha habido poca investigación sobre los mecanismos interactivos entre el salidrósido y la VC desde las perspectivas de la bioinformática y la farmacología de redes.

Esta investigación construye un mapa de red molecular del impacto potencial de salidrósido en VC mediante la identificación y el análisis de objetivos clave a través de una extensa minería de bases de datos. Se genera una red de interacción proteína-proteína (PPI) y se aplica un análisis topológico para resaltar los nodos críticos en el proceso de calcificación.

Para confirmar las predicciones computacionales, se desarrolla un modelo de VC en ratas mediante la administración de una dieta alta en grasas con vitamina D3 (VD3). Este modelo replica las características patológicas de la VC humana. La lesión vascular se evalúa a través de técnicas histológicas, los perfiles lipídicos séricos y los marcadores de inflamación se evalúan para investigar los efectos sistémicos del salidrósido, y la expresión de las proteínas relacionadas con SAL anti-VC se mide mediante Western blot para explorar el impacto del salidrósido en la VC inducida experimentalmente, este estudio tiene como objetivo aportar información valiosa sobre el potencial de este compuesto como estrategia terapéutica para combatir la VC.

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina China de Changchun (Aprobación Nº 2023091). Este estudio se adhiere a las directrices internacionales, incluidas las Directrices de la Comunidad Europea y la Directiva CEE de 1986, lo que garantiza el tratamiento ético de los animales durante todo el estudio. Para el estudio se utilizaron ratas Wistar macho (8-10 semanas, peso 200-220 g). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Predicción farmacológica de la red de posibles dianas de salidrósido-VC

NOTA: La farmacología de redes utiliza métodos computacionales y análisis de datos a gran escala para investigar las complejas interacciones entre las moléculas de los fármacos y los objetivos biológicos, como las vías, los genes y las proteínas dentro de un organismo^11,12. Este enfoque ayuda a descifrar las funciones y relaciones biológicas de las entidades estudiadas. La metodología abarca la utilización de bases de datos, el procesamiento de información química, la adquisición de datos de bioactividad, la recuperación de datos de proteínas, el análisis de perfiles de expresión génica, la construcción de redes de interacción y el análisis de enriquecimiento de vías¹¹. La Figura 1 muestra la red de interacción de los objetivos principales entre el salidrósido y la calcificación vascular.

1. Construcción de la base de datos de objetivos "Ingredientes"
   1. Utilice "Salidroside" como palabra clave para los ingredientes en las bases de datos¹³ (véase la Tabla complementaria 1), como HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA y STITCH.
   2. Revisar la literatura relevante para identificar objetivos asociados con el salidrósido, con la especie establecida en Homo sapiens. Después de eliminar los duplicados, estandarizar las proteínas diana utilizando UniProt (véase la Tabla Suplementaria 1) y establecer una base de datos completa de dianas de Salidroside¹⁴.
2. Construcción de la base de datos objetivo "Enfermedad"
   1. Utilice "Calcificación vascular" como palabra clave para buscar en las bases de datos¹⁵ (véase la Tabla complementaria 1), incluidas GeneCards, OMIM, PharmGkb y DrugBank, con las especies establecidas en Homo sapiens. Después de la deduplicación, cree una base de datos de objetivos de calcificación vascular.
3. Predicción de posibles dianas terapéuticas
   1. Introduzca los objetivos para el salidrósido y la calcificación vascular (consulte la Tabla complementaria 1) para identificar los objetivos comunes. Generar un diagrama de Venn para visualizar las posibles dianas terapéuticas del salidrósido en el tratamiento de la calcificación vascular.
4. Construcción de la red de interacción proteína-proteína (IBP) "Salidroside-Calcificación vascular"
   1. Compile los objetivos potenciales en una Lista de Proteínas Múltiples y analícelos utilizando STRING (ver Tabla Suplementaria 1), con el organismo establecido en Homo sapiens y la puntuación de interacción establecida en confianza media (>0.4)¹⁶. Extraiga los datos de PPI en formato TSV para su posterior análisis.
      NOTA: Dado que el 85% de los genes de rata son homólogos a genes humanos, realizando funciones biológicas similares, se seleccionaron ratas como sujetos experimentales para validar los efectos del salidrósido sobre la calcificación vascular¹⁷.
5. Selección y construcción de redes de objetivos clave
   1. Importe los datos de la red PPI en Cytoscape 3.9.1 (consulte la Tabla complementaria 1) para su análisis utilizando el complemento CytoNCA para evaluar parámetros como la intermediación (BC), la cercanía (CC), el grado (DC), el vector propio (EC), la conectividad promedio local (LAC) y la centralidad de la red (NC). Seleccione los objetivos clave con CC=1 para construir un mapa de espectro de acción de objetivos principales para 'SAL-VC'.
   2. Utilice el complemento CytoHubba para identificar los 10 genes hub principales en función de los cálculos de Centralidad de Camarilla Máxima (MCC), Componente de Vecindario Máximo (MNC) y Grado, generando un mapa de espectro de genes Hub.
6. Análisis de enriquecimiento de las vías GO y KEGG
   1. Realice la conversión de ID de genes utilizando DAVID (consulte la Tabla complementaria 1), seleccionando ENSEMBL_GENE_ID para el tipo de gen 9606 para obtener información sobre la especie. Analice la lista de genes convertidos utilizando Omicshare (ver Tabla suplementaria 1) para el enriquecimiento funcional de GO y de la vía KEGG, con una significación establecida en un valor de P < 0,05¹⁸.
      NOTA: El análisis funcional de GO incluye la función molecular (MF), el proceso biológico (BP) y el componente celular (CC). El análisis de la vía KEGG implica el enriquecimiento de la vía y el enriquecimiento de la clasificación de la vía¹⁹. Los resultados del análisis de enriquecimiento se muestran en la Figura 2.

2. Experimento con animales

1. Aclimatación
   1. Aclimata ratas Wistar en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Asegurarse de que tengan acceso ad libitum a alimentos y agua para mantener su salud antes del comienzo de los experimentos. Realizar alimentación adaptativa durante 1 semana.
2. Establecimiento modelo
   1. Aclimatar a las ratas a las condiciones ambientales y asignarlas aleatoriamente a cinco grupos: grupo de control (Ctrl, ND + Vehículo), grupo de modelo (modelo, HFD + vehículo), grupo de dosis baja de SAL (SAL-L, HFD + SAL 5 mg/kg), grupo de dosis alta de SAL (SAL-H, HFD + SAL 10 mg/kg) y grupo de simvastatina (SIM) (HFD + SIM 5 mg/kg).
   2. Administrar una dieta normal (ND) al grupo Ctrl y una dieta alta en grasas (HFD) a los grupos restantes durante toda la duración del experimento. El primer día de administración de HFD, inyectar una dosis subcutánea única de 600.000 UI/kg VD3 a todos los grupos excepto al grupo Ctrl^20,21. A continuación, se administran inyecciones subcutáneas semanales de 100.000 UI/kg de VD3 durante las siguientes 8 semanas (Figura 3).
   3. Controlar diariamente el estado de salud y la supervivencia de los animales. Iniciar las intervenciones experimentales en la novena semana.
   4. Sacrificar a los animales al final del estudio (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Recoger muestras de suero, dejarlas reposar durante 30 minutos y centrifugar para aislar el suero (siguiendo los informes publicados anteriormente^20,21). Diseccionar los tejidos vasculares (aorta abdominal) y enjuagar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre.
   5. Fije una porción del tejido en paraformaldehído al 4% para el examen histológico y almacene otra porción en nitrógeno líquido para el análisis molecular.
      NOTA: Diluya el salidrósido con agua tibia antes de usar.

3. Evaluación de la lesión del tejido vascular mediante tinción HE, VK, EVG

NOTA: Fijar el tejido vascular (aorta abdominal) en paraformaldehído al 4%, deshidratado en etanol después de 48 h e incrustado en parafina. Corte los bloques de parafina incrustados en rodajas de 5 μm para la tinción con hematoxilina-eosina (HE), Elastica van Gieson (EVG) y Von Kossa (VK), y observe la morfología histológica bajo un microscopio óptico. La tinción HE se utiliza para evaluar los cambios en la morfología del tejido. En el tejido vascular, destaca las alteraciones estructurales en la pared del vaso, incluida la proliferación de células musculares lisas, la disposición celular desorganizada y la inflamación. La tinción EVG visualiza las fibras elásticas y de colágeno, lo cual es esencial para evaluar el daño o la remodelación de las fibras elásticas en el tejido vascular y ayuda a comprender el impacto de la calcificación en la elasticidad vascular. La tinción con VK detecta depósitos de calcio, una característica clave en la VC, por lo que es crucial para evaluar el alcance y la distribución de la calcificación en el tejido vascular^22,23.

1. Tinción HE para la detección de daños en el tejido vascular
   1. Desparafinación y rehidratación
      1. Desparafinar las secciones en dos cambios de xileno durante 8 min cada una y rehidratar a través de una serie de etanol graduada (100%, 95%, 85%, 75%) durante 3 min por paso. A continuación, enjuague de 2 minutos con agua corriente del grifo.
   2. Tinción con hematoxilina
      1. Tiñe las secciones con hematoxilina durante 5-10 minutos y lávalas para eliminar el exceso de mancha, seguido de un enjuague con agua corriente del grifo.
         NOTA: Se recomienda una tinción ligera de 5 min para evitar tinciones demasiado oscuras, que pueden afectar el color citoplasmático.
   3. Diferenciación
      1. Diferencie las secciones en una solución de diferenciación durante 30 s, seguidas de dos enjuagues con agua del grifo durante 3 minutos cada una.
   4. Contratinción de eosina
      1. Coloque las secciones en la tinción de eosina durante 1 min. Después de eliminar el exceso de mancha, realice una deshidratación rápida.
   5. Deshidratación, clarificación y montaje
      1. Para una deshidratación rápida, sumerja las secciones en etanol al 75%, 85%, 95% y 100% durante 3 s cada una, seguidas de etanol al 100% durante 1 min.
         NOTA: Se recomienda una deshidratación rápida ya que la eosina puede perder color en los gradientes de agua y etanol.
2. Tinción VK para la detección de calcio
   1. Desparafinación y rehidratación
      1. Realice este paso siguiendo el paso 3.1.1.
   2. Reacción del nitrato de plata
      1. Seque las secciones, delinee con un pincel fino y tiña con Von Kossa (ver Tabla de Materiales). Exponerlos a la luz ultravioleta durante 4 h, luego enjuagar bien con agua corriente del grifo.
   3. Contratinción con hematoxilina
      1. Teñir las secciones con hematoxilina durante 5 minutos, enjuagar con agua corriente del grifo, diferenciar y enjuagar nuevamente, seguido de un enjuague con agua corriente del grifo.
   4. Contratinción de eosina
      1. Deshidratar las secciones con etanol graduado (85% y 95% durante 5 minutos cada una), luego teñir con eosina durante 5 minutos.
   5. Deshidratación y montaje
      1. Deshidratar las secciones en baños de etanol (100% Etanol I, II, III durante 5 min cada uno) y clarificar en baños de xileno (Xileno I y II durante 5 min cada uno). A continuación, monta las secciones con bálsamo neutro.
   6. Examen microscópico y captura de imágenes
      1. Examine las secciones manchadas bajo un microscopio óptico y capture imágenes para su análisis.
         NOTA: Asegúrese de que los depósitos de calcio aparezcan de color marrón negruzco a negro oscuro, los núcleos sean azules y el fondo sea rojo. Prepare la solución de nitrato de plata para la tinción fresca de VK inmediatamente antes de usarla.
3. Tinción EVG para fibras elásticas y de colágeno
   1. Desparafinación y rehidratación
      1. Trate las secciones de parafina con calor durante 50 minutos, luego sumérjalas en xileno durante 20 minutos para eliminar la parafina. Proceda sometiendo las secciones a una serie de etanol graduada (100%, 95%, 85%, 75%) durante 5 minutos cada una, concluyendo con un enjuague con agua corriente del grifo durante 5 minutos.
   2. Tinción EVG
      1. Aplique la solución de tinción EVG (consulte la tabla de materiales) durante 10 minutos, luego enjuague brevemente con agua corriente del grifo durante 5 s para eliminar el exceso de mancha.
      2. A continuación, aplique la solución de trabajo de Verhoeff (consulte la tabla de materiales) durante 5 minutos, seguido de otro breve enjuague con agua corriente del grifo durante 5 s. Aplique la solución diferenciadora de Verhoeff durante 5 s hasta que las fibras de elastina sean claramente visibles, y luego enjuague con agua corriente del grifo durante 5 s.
         NOTA: Mezcle los componentes A, B y C (provistos en el kit disponible comercialmente) en una proporción de 5:2:2 para preparar la solución de trabajo de Verhoeff antes de usarla. Use la solución dentro de las 2 horas y reponga según sea necesario durante el proceso de tinción para evitar que las secciones se sequen.
   3. Deshidratación y montaje
      1. Deshidratar las secciones a través de una serie de etanol graduadas (75%, 85%, 95% y 100%) durante 5 s cada una, seguidas de una clarificación en dos cambios de xileno durante 1 min cada una. Después de un breve período de secado al aire, monte las secciones con bálsamo neutro.
   4. Examen microscópico y análisis de imágenes
      1. Examine las secciones teñidas bajo un microscopio óptico para visualizar las fibras elásticas y de colágeno, y capture imágenes para su posterior análisis.

4. Ensayo de fosfatasa alcalina (ALP)

NOTA: Utilice la fosfatasa alcalina como indicador clave para evaluar la eficacia de los tratamientos anticalcificantes.

1. Preparación de reactivos
   1. Disuelva el sustrato revelador de color en un tampón de carbonato de pH 9,6 de 0,05 M helado hasta un volumen final de 2,5 mL.
      NOTA: Prepare el tampón disolviendo 1,59 g de carbonato de sodio y 2,93 g de bicarbonato de sodio en 1.000 mL de agua bidestilada.
2. Dilución del sustrato
   1. Diluir 10 μL de solución de p-nitrofenol (10 mM) con tampón de carbonato de pH 9,6 de 0,05 M hasta un volumen final de 0,2 mL para lograr una concentración final de 0,5 mM.
3. Preparación de la muestra
   1. Homogeneizar la aorta abdominal en tampón de lisis. Centrifugar el homogeneizado (~12.000 x g durante 10 min a 4 °C) y recoger el sobrenadante para la detección de la actividad de ALP.
      NOTA: Asegúrese de que el tampón de lisis esté libre de inhibidores de la fosfatasa. Almacene las muestras de prueba pendientes a -80 °C, evitando ciclos repetidos de congelación y descongelación.
4. Preparación de microplacas para ensayos
   1. Prepare una placa de 96 pocillos con pocillos en blanco, estándar y de muestra. Agregue 50 μL de la solución estándar a los pocillos estándar y 50 μL de muestras de prueba pendientes a los pocillos de muestreo. Incubar la placa a 37 °C durante 10 min.
5. Terminación de reacción y medición de absorbancia
   1. Agregue 100 μL de solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción. Mida la absorbancia a 405 nm y calcule la actividad de ALP en función de los valores de absorbancia (siguiendo las instrucciones del fabricante, consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Los pocillos que contienen el estándar o muestras con actividad ALP mostrarán diferentes tonos de amarillo. El color es estable hasta por 2 h.

5. Determinación del contenido de calcio

NOTA: La determinación del contenido de calcio es fundamental para evaluar el grado de mineralización en los tejidos biológicos.

1. Preparación de tejidos
   1. Picar el tejido en trozos pequeños y homogeneizar en tampón de lisis.
2. Dilución y centrifugación de muestras
   1. Diluir el tejido en tampón de lisis en una proporción de 1:10. Homogeneizar la mezcla y centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 5 min. Recoja el sobrenadante para su análisis.
      NOTA: Prepare diluciones estándar de calcio (0-1.0 mM) usando una solución estándar de calcio de 5 mM (ver Tabla de Materiales).
3. Configuración de placas e incubación
   1. Agregue 50 μL de muestras estándar o de prueba a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añadir 150 μL de solución de trabajo para ensayos, mezclar bien e incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min. Mida la absorbancia a 575 nm y construya una curva estándar.
4. Cálculo del contenido de calcio
   1. Calcule el contenido de calcio utilizando la curva estándar, incorporando el factor de dilución, el volumen de la muestra y el peso atómico del calcio.

6. Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para citocinas inflamatorias (IL-6, TNF-α, IL-1β)

NOTA: La IL-6, la IL-1β y el TNF-α son citocinas proinflamatorias clave que indican la presencia y la gravedad de una respuesta inflamatoria. La medición de estas citocinas es esencial para comprender el proceso inflamatorio y evaluar la eficacia de los tratamientos antiinflamatorios.

1. Recogida de muestras
   1. Recoge suero de la aorta abdominal de la rata. Deje que se coagule a temperatura ambiente durante 2 h. Centrifugar la muestra a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante.
2. Preparación de la microplaca para el ensayo
   1. Prepare una placa de 96 pocillos con pocillos designados para patrones y muestras de prueba. Agregue 50 μL de patrones (consulte la Tabla de Materiales) a diferentes concentraciones a los pocillos apropiados.
3. Preparación de la muestra
   1. Añada 40 μL de diluyente de muestra a cada pocillo designado para muestras de ensayo. Agregue 10 μL de la muestra a los mismos pocillos, lo que resulta en una dilución de 5 veces.
4. Incubación con reactivos marcados con enzimas
   1. Agregue 100 μL de reactivos marcados con enzimas específicos para IL-6, TNF-α o IL-1β a todos los pocillos excepto al blanco. Incubar la placa a 37 °C durante 60 min.
5. Lavado
   1. Deseche el líquido de todos los pocillos excepto el blanco. Lave los pocillos con 1 solución de lavado (preparada como una dilución de 20 veces en agua destilada). Repita este paso de lavado cinco veces y seque los pozos.
6. Desarrollo y terminación del color
   1. Agregue 50 μL de soluciones de sustrato A y B (del kit disponible comercialmente, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Mezclar suavemente e incubar la placa a 37 °C en la oscuridad durante 15 min. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción.
7. Medición de absorbancia y análisis de datos
   1. Establezca el pozo en blanco como cero. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Genere una curva estándar basada en los valores de OD y las concentraciones estándar. Calcule las concentraciones de la muestra mediante interpolación y ajuste el factor de dilución.

7. Ensayo del perfil lipídico

NOTA: El ensayo de perfil lipídico detecta niveles anormales de lípidos, donde los niveles de lípidos elevados o desequilibrados pueden acelerar el riesgo de calcificación vascular.

1. Colesterol total y triglicéridos (CT y TG)
   1. Recoja el suero y prepare una placa de 96 pocillos con pocillos designados para muestras en blanco, de calibración y de prueba pendientes. Agregue 2,5 μL de suero, patrón de calibración o solución en blanco a cada pocillo.
   2. Agregue 250 μL de la solución de trabajo a cada pocillo. Mezclar suavemente e incubar la placa a 37 °C durante 10 min. Mida la absorbancia a 500 nm utilizando un lector de microplacas.
2. Lipoproteínas de baja densidad y lipoproteínas de alta densidad (LDL-C y HDL-C)
   1. Recoja el suero y prepare una placa de 96 pocillos con pocillos designados para muestras en blanco, de calibración y de prueba pendientes. Agregue 2,5 μL de suero, patrón de calibración o solución en blanco a los pocillos respectivos.
   2. Añada el reactivo adecuado (reactivo uno para 180 μl o reactivo dos para 60 μl, consulte la tabla de materiales) a cada pocillo como se especifica en las instrucciones del kit de ensayo. Incubar a la temperatura (37 °C) y durante el tiempo (Reactivo Uno durante 5 min o Reactivo Dos durante 10 min) recomendados para cada reactivo.
   3. Mida la absorbancia a la longitud de onda específica (600 nm) indicada para LDL-C o HDL-C utilizando un lector de microplacas.

8. Western blot

NOTA: El Western blot (WB) es fundamental para evaluar los niveles de expresión de proteínas clave, lo que permite la detección de formas totales y fosforiladas.

1. Preparación de tejidos
   1. Pesar 0,05 g de pañuelo de papel y enjuagar bien con PBS para eliminar el exceso de residuos. Añadir 500 μL de tampón de lisis que contenga 1x inhibidores de fosfatasa y proteasa. Incubar el tejido a 4 °C durante 10 min y homogeneizarlo con un triturador de tejidos.
2. Extracción de proteínas
   1. Deje reposar la muestra homogeneizada durante 1 min, luego centrifuga a 4 °C y 12.000 x g durante 15 min. Recoja el sobrenadante para el análisis de proteínas. Determine la concentración de proteínas utilizando el método BCA siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Utilice una curva estándar para calcular la concentración.
      NOTA: Enfríe previamente la centrífuga a 4 °C antes de usarla. Mida la concentración de proteínas a 562 nm.
3. Preparación de la muestra
   1. Mezcle la muestra de proteína con tampón de carga 5x que contenga β-mercaptoetanol y SDS en una proporción de 4:1. Calentar la mezcla a 100 °C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas.
      NOTA: Si se requiere un tampón de carga 1x, diluya el tampón 5x con tampón de lisis.
4. Preparación del gel SDS-PAGE
   1. Prepare un gel SDS-PAGE al 12% y colóquelo en el aparato de electroforesis. Agregue 1x tampón de electroforesis hasta la mitad del camino según las instrucciones (consulte la Tabla complementaria 2).
5. Electroforesis
   1. Recupere las muestras de proteínas a -20 °C. Cargue 60 μg de proteína por pocillo y ejecute el gel.
   2. Ajuste la corriente a 50 mA durante 20 min para el gel de apilamiento, luego aumente a 100 mA durante 60 min para el gel separador hasta que el frente del tinte llegue al fondo.
6. Transferencia de membranas
   1. Activar la membrana de PVDF en metanol durante 5 min.
   2. Ensamble el sándwich de transferencia en el siguiente orden: papel de filtro → gel SDS-PAGE → membrana de PVDF → papel de filtro. Transfiera proteínas a 300 mA durante 60 min.
      NOTA: Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas entre el gel SDS-PAGE y la membrana de PVDF.
7. Bloqueante
   1. Incubar la membrana de PVDF en BSA al 5% (preparado en 1x TBST) a temperatura ambiente agitando suavemente durante 60 min. Lave la membrana con 1x TBST tres veces durante 5 minutos cada una.
8. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Incubar la membrana en 5 mL del anticuerpo primario apropiado (por ejemplo, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB, p65, NF-κB, p65, IκBα) diluido en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2,5 h.
9. Incubación secundaria de anticuerpos
   1. Lave la membrana con 1x TBST tres veces durante 5 minutos cada una después de la incubación primaria de anticuerpos. Incubar con el anticuerpo secundario adecuado a temperatura ambiente durante 1 h. Vuelva a lavar la membrana con 1x TBST tres veces durante 5 minutos cada una.
10. Detección
    1. Visualice las bandas de proteínas mediante la detección de quimioluminiscencia ECL²⁴ (consulte la tabla de materiales).
11. Análisis de densitometría
    1. Cuantifique las bandas de proteínas con el software ImageJ. Siga este flujo de trabajo en ImageJ: Image → 8-bit → Process → Substra Background. Analice → establezca medidas → analice → escala establecida. Edite → invierta → analice → mida → resultados. Archivo → Guardar como → IntDen.
    2. Genere gráficos estadísticos utilizando software de gráficos y análisis estadístico.
       NOTA: Asegúrese de que los resultados sean coherentes en todas las réplicas para validar los hallazgos.

9. Análisis estadístico

1. Recopile y organice datos con GraphPad Prism 9.0.
2. Calcule y trace las barras de error utilizando la media ± SD de los datos sin procesar.
3. Realice análisis estadísticos utilizando ANOVA de un factor, seguido de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples.
4. Determine la significancia estadística a P < 0.05, donde los valores de P más pequeños indican mayores diferencias en los resultados.

Resultados

Análisis de farmacología de red

Utilizando bases de datos como HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA y STITCH, se identificaron 388 genes diana potenciales para el salidrósido. Además, se recuperaron 2871 genes diana potenciales relacionados con la VC de bases de datos como GeneCards, OMIM, PharmGkb y DrugBank. El análisis de intersección a través de diagramas VENN reveló 208 objetivos superpuestos,...

Discusión

La VC se caracteriza por cambios degenerativos en las células y tejidos vasculares, con depósitos minerales patológicos dentro de los vasos sanguíneos que conducen al endurecimiento de las paredes de los vasos o a la formación de placas ateroscleróticas, que pueden dar lugar a enfermedades vasculares obstructivas²⁵. Los estudios muestran que alrededor del 85% de las placas de VC pueden evolucionar a trombosis, lo que puede desencadenar episodios cardiovascul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% (29:1) Acrylamide/Bis Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	A1010
4% Paraformaldehyde Fix Solution	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0099
5*loading buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	P1040
Alkaline Phosphatase Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0321S
AlphaView Software	Proteinsimple Inc.USA	AlphaView SA
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0012
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1866
Calcium Colorimetric Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	S1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1597
Dewatering machine	Diapath Biosciences  Ltd, Italy	Donatello
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd,China	JB-P5
Enzyme-labeled instrument	Biotek Co., Ltd,USA	Epoch
Ethanol absolute	GHTECH  Co., Ltd, China	64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP	Bioworld technology, co, Ltd.,China	BS20242-Y
GraphPad Prism Software	GraphPad Software.,USA	GraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	A0208
Image J Software	National Institutes of Health(NIH),USA	Image J
IκB Alpha Polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10268-1-AP
JAK2 Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A113
NF-κB p65 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10745-1-AP
Pathological microtome	Leica Biosystems,USA	RM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail Tables	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF2006
Phospho-STAT3(S727) Antibody	Abways  Science & Technology Co., Ltd ,China	CY5291
Protease Inhibitor Cocktail	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	11873580001
PVDF membrane	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	3010040001
Rat IL-1β ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI303
Rat IL-6 ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI328
Rat TNF-α ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PT516
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0013B
Salisoroside	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,China	S25475
SDS	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China	3250KG001
Sodium carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	1001921933
Sodium hydrogen carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	10018960
Sodium thiosulfate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	20042518
STAT3 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10253-2-AP
TBST (10×)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	ST673
Total cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A111
Triglyceride assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A110
Tris Base	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	1115GR500
Upright optical microscope	Nikon Corporation,Japan	Eclipse E100
Von Kossa Solution	Wuhan servicebio technology CO.,LTD,China	G1043
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc. ,USA	SC-2048
β-Actin antibody	Cell Signaling Technology, Inc.,USA	E4967