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  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein Rattenmodell für die Gefäßverkalkung etabliert, die durch eine fettreiche Diät (HFD) in Kombination mit Vitamin D3 (VD3) induziert wird. Das Modell wurde verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit von Salidrosid bei der Vorbeugung und Behandlung von Gefäßverkalkungen zu bewerten und Einblicke in seine potenziellen Wirkmechanismen durch Netzwerkpharmakologie und in vivo-Experimente zu geben.

Zusammenfassung

Die Gefäßverkalkung (VC) ist ein kritischer pathologischer Zustand, der mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität einhergeht. Diese Studie verwendet einen hybriden Ansatz aus Netzwerkpharmakologie und Molekularbiologie, um die therapeutischen Mechanismen von Salidrosid (SAL), einem Wirkstoff aus Rhodiola crenulata, gegen VC abzugrenzen. Durch Datenbank-Mining und Netzwerkanalyse wurden 388 SAL-Ziele identifiziert, die sich mit 2871 VC-assoziierten Zielen überschneiden, was zu 208 gemeinsamen Zielen führt. Ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI), das über die String-Datenbank und die topologische Analyse in Cytoscape 3.9.1 erstellt wurde, identifizierte 10 Schlüsselziele, darunter IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 und STAT3. Die identifizierten Gene waren in den Lipid- und Atherosklerose-Signalwegen konzentriert, was darauf hindeutet, dass die Verbesserung der VC durch SAL durch die Regulation einer abnormalen Expression von Lipid- und Entzündungsfaktoren erfolgen kann. Es wurde auch festgestellt, dass SAL die abnormale Expression von Entzündungsfaktoren hemmt und dadurch den JAK2/STAT3-Signalweg aktiviert, um in das Fortschreiten der VC einzugreifen. Der JAK2/STAT3-Signalweg ist ein wichtiger molekularer Mechanismus, durch den SAL eine weitere Verschlechterung der VC verhindert. Funktionelle Anreicherungsanalysen zeigten, dass diese Ziele an Entzündungsreaktionen und Fettstoffwechsel beteiligt sind, den zentralen Signalwegen bei VC. In-vivo-Studien an Ratten zeigten die Wirksamkeit von SAL bei der Linderung von Dyslipidämie und vaskulären Entzündungen mit verbesserten Serumlipidprofilen und reduzierter vaskulärer Kalziumablagerung. Die mechanistische Untersuchung, die auf der Western-Blot-Analyse basiert, demonstrierte die Fähigkeit von Salidrosid, den JAK2/STAT3-Signalweg zu regulieren, was sein Potenzial als Modulator in diesem kritischen molekularen Mechanismus unterstreicht und ein potenzielles therapeutisches Ziel für VC bietet. Die Stärke dieser Forschung liegt in ihrer methodischen Strenge, die rechnerische Vorhersagen mit In-vivo-Validierungen integriert. Dieser umfassende Ansatz schafft einen robusten Rahmen für die Erforschung der therapeutischen Mechanismen von Naturstoffen bei der Bekämpfung von VC.

Einleitung

Gefäßverkalkung (VC) bezieht sich auf die abnormale Ablagerung von Kalzium in den Gefäßwänden, die zu einer arteriellen Versteifung und verminderter Elastizität führt, was letztendlich die Gefäßfunktion beeinträchtigt. Traditionell wird VC in zwei Arten unterteilt: Intimaverkalkung, die mit Lipidaufbau verbunden ist, und mediale Verkalkung. Ersteres ist eng mit der entzündlichen Infiltration verbunden und löst eine osteogene Transformation in der Gefäßwand aus, die durch die Migration, Proliferation und Differenzierung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in osteoblastenähnliche Zellen gekennzeichnetist 1.

Die Fähigkeit von VSMCs, eine osteogene Differenzierung zu durchlaufen, die von Faktoren wie Alterung, Genetik und Umweltbedingungen wie Diabetes und chronischen Nierenerkrankungen beeinflusst wird, trägt wesentlich zur altersbedingten VC bei. Diese osteoblastenähnliche Umwandlung verschlimmert die arterielle Verkalkung und Degeneration1.

VC ist eine vielschichtige Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen, metabolische Ungleichgewichte und verschiedene systemische Erkrankungen verursacht wird. Etwa 80 % der Gefäßverletzungen und 90 % der Fälle von koronarer Herzkrankheit weisen VC auf, was das Risiko schwerer kardiovaskulärer Ereignisse signifikant erhöht 1,2. Daher besteht ein dringender Bedarf, pharmakologische Behandlungen zu finden, die diesen Zustand wirksam mildern oder umkehren.

Derzeit beinhalten die Behandlungsstrategien für VC verschiedene pharmakologische Interventionen, obwohl keine Medikamente speziell für diesen Zweck entwickelt wurden. Bei Patienten mit leichter Verkalkung werden häufig Statine verschrieben, um Plaques zu stabilisieren. Obwohl sie die Koronararterienstenose durch Senkung des Lipidspiegels reduzieren können, ist ihre Wirkung auf die Verkalkung begrenzt2.

Angesichts der Komplexität der Atherosklerose weisen viele Patienten eine erhöhte Thrombozytenaktivierung auf, was die Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern wie Aspirin oder Clopidogrel erforderlich macht, um die Thrombozytenaggregation zu hemmen und das Thromboserisiko zu verringern. Die Aspirin-Therapie ist jedoch nur für Personen mit einem hohen Kalziumwert der Koronararterien und einem geringen Blutungsrisiko von Vorteil3.

Darüber hinaus deutet die Forschung an Nahrungsergänzungsmitteln wie Vitamin K auf ein Potenzial bei der Verhinderung des Fortschreitens von VChin 4. In schweren Fällen können invasive Eingriffe in Betracht gezogen werden, obwohl sie bei einer weit verbreiteten VC5 oft ungeeignet sind. Für Personen ohne vorhandene VC bleibt der Umgang mit Risikofaktoren wie Blutdruck, Lipidprofilen und Lebensstilentscheidungen von entscheidender Bedeutung6.

Rhodiola crenulata, ein mehrjähriges Kraut aus der Familie der Crassulaceae, wird traditionell in der chinesischen Medizin verwendet. Sein bioaktiver Hauptbestandteil, Salidrosid, verdient aufgrund seiner bemerkenswerten biologischen Aktivitäten große Aufmerksamkeit. Salidrosid ist bekannt für seine Fähigkeit, die Apoptose zu hemmen, robuste antioxidative Eigenschaften zu aufweisen und entzündungshemmende Eigenschaften zu besitzen 7,8. Diese Eigenschaften tragen zu seinem Potenzial bei, die Gefäßfunktion zu verbessern, die Gefäßalterung zu verzögern und das Gefäßendothel zu schützen. Als potenzielles Therapeutikum für VC ist Salidrosid von erheblichem Wert für die Forschung. Die genauen Mechanismen, durch die Salidrosid VC verbessert, müssen jedoch noch vollständig geklärt werden und rechtfertigen weitere Untersuchungen, um sein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von VC zu nutzen.

Um diese Mechanismen zu erforschen, nutzt diese Studie die Netzwerkpharmakologie, eine innovative Methodik, die Pharmakologie, Bioinformatik und Informatik kombiniert, um biologische Systeme zu analysieren und Arzneimittelmechanismen aufzuklären. Im Vergleich zur traditionellen Einzelziel-Wirkstoffforschung bietet die Netzwerkpharmakologie einen umfassenderen Ansatz, indem sie die Auswirkungen eines Medikaments auf mehrere biologische Ziele und Signalwege analysiert. Als Schlüsselwerkzeug in der modernen Arzneimittelentwicklung konstruiert es Netzwerke von Medikamenten, Zielen und Signalwegen, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Wirkstoffwirkung aufzudecken 9,10. Trotz seiner umfangreichen Verwendung bei der Erforschung therapeutischer Mechanismen wurden die interaktiven Mechanismen zwischen Salidrosid und VC aus der Perspektive der Bioinformatik und Netzwerkpharmakologie nur begrenzt erforscht.

Diese Forschung erstellt eine molekulare Netzwerkkarte der potenziellen Auswirkungen von Salidrosid auf VC, indem sie Schlüsselziele durch umfangreiches Datenbank-Mining identifiziert und analysiert. Es wird ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) generiert, und die topologische Analyse wird angewendet, um kritische Knoten im Kalzifizierungsprozess hervorzuheben.

Um die rechnerischen Vorhersagen zu bestätigen, wird ein Rattenmodell für VC entwickelt, indem eine fettreiche Diät mit Vitamin D3 (VD3) verabreicht wird. Dieses Modell repliziert die pathologischen Merkmale der menschlichen VC. Gefäßschäden werden durch histologische Techniken beurteilt, Serumlipidprofile und Entzündungsmarker werden ausgewertet, um die systemischen Wirkungen von Salidrosid zu untersuchen, und die Expression von SAL-Anti-VC-verwandten Proteinen wird mittels Western Blotting gemessen. Um die Auswirkungen von Salidrosid auf experimentell induzierte VC zu untersuchen, zielt diese Studie darauf ab, wertvolle Einblicke in das Potenzial dieser Verbindung als therapeutische Strategie zur Bekämpfung von VC zu liefern.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Experimental Animals Committee der Changchun University of Chinese Medicine genehmigt (Zulassung Nr. 2023091). Diese Studie hält sich an internationale Richtlinien, einschließlich der Leitlinien der Europäischen Gemeinschaft und der EWG-Richtlinie von 1986, die eine ethische Behandlung von Tieren während der gesamten Studie gewährleisten. Für die Studie wurden männliche Wistar-Ratten (8-10 Wochen, Gewicht 200-220 g) verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Netzwerkpharmakologische Vorhersage potenzieller Salidrosid-VC-Ziele

HINWEIS: Die Netzwerkpharmakologie nutzt computergestützte Methoden und groß angelegte Datenanalysen, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Arzneimittelmolekülen und biologischen Zielen wie Signalwegen, Genen und Proteinen innerhalb eines Organismus zu untersuchen11,12. Dieser Ansatz hilft, die biologischen Funktionen und Beziehungen der untersuchten Entitäten zu entschlüsseln. Die Methodik umfasst die Nutzung von Datenbanken, die Verarbeitung chemischer Informationen, die Erfassung von Bioaktivitätsdaten, das Abrufen von Proteindaten, die Analyse von Genexpressionsprofilen, den Aufbau von Interaktionsnetzwerken und die Anreicherungsanalyse von Signalwegen11. Abbildung 1 zeigt das Interaktionsnetzwerk der Kernziele zwischen Salidrosid und Gefäßverkalkung.

  1. Aufbau der Zieldatenbank "Ingredient"
    1. Verwenden Sie "Salidrosid" als Schlüsselwort für Inhaltsstoffe, um Datenbanken13 zu durchsuchen (siehe Ergänzende Tabelle 1), wie z. B. HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA und STITCH.
    2. Überprüfen Sie die einschlägige Literatur, um Ziele zu identifizieren, die mit Salidrosid assoziiert sind, wobei die Spezies auf Homo sapiens festgelegt ist. Nach dem Entfernen von Duplikaten standardisieren Sie die Zielproteine mit UniProt (siehe Ergänzende Tabelle 1) und etablieren eine umfassende Salidrosid-Zieldatenbank14.
  2. Aufbau der Zieldatenbank "Krankheit"
    1. Verwenden Sie "Gefäßverkalkung" als Schlüsselwort, um Datenbanken15 zu durchsuchen (siehe ergänzende Tabelle 1), einschließlich GeneCards, OMIM, PharmGkb und DrugBank, wobei die Spezies auf Homo sapiens festgelegt ist. Erstellen Sie nach der Deduplizierung eine Zieldatenbank für die Gefäßverkalkung.
  3. Vorhersage potenzieller therapeutischer Ziele
    1. Geben Sie die Ziele für Salidrosid und Gefäßverkalkung ein (siehe Ergänzende Tabelle 1), um gemeinsame Ziele zu identifizieren. Erstellen Sie ein Venn-Diagramm, um die potenziellen therapeutischen Ziele für Salidrosid bei der Behandlung von Gefäßverkalkung zu visualisieren.
  4. Aufbau des Protein-Protein-Interaktions-Netzwerks (PPI) "Salidrosid-Vascular Calcification"
    1. Stellen Sie die potenziellen Ziele in einer Liste mehrerer Proteine zusammen und analysieren Sie sie mit STRING (siehe Ergänzende Tabelle 1), wobei der Organismus auf Homo sapiens und der Interaktionswert auf mittlere Konfidenz (>0,4)16 eingestellt ist. Extrahieren Sie die PPI-Daten im TSV-Format für die weitere Analyse.
      ANMERKUNG: Angesichts der Tatsache, dass 85 % der Gene der Ratte homolog zu menschlichen Genen sind und ähnliche biologische Funktionen erfüllen, wurden Ratten als Versuchspersonen ausgewählt, um die Auswirkungen von Salidrosid auf die Gefäßverkalkung zu validieren17.
  5. Auswahl und Netzwerkaufbau der wichtigsten Ziele
    1. Importieren Sie die PPI-Netzwerkdaten in Cytoscape 3.9.1 (siehe Ergänzende Tabelle 1) zur Analyse mit dem CytoNCA-Plugin, um Parameter wie Betweenness (BC), Closeness (CC), Degree (DC), Eigenvector (EC), Local Average Connectivity (LAC) und Network Centrality (NC) zu bewerten. Wählen Sie Schlüsselziele mit CC=1 aus, um eine Kernziel-Aktionsspektrumkarte für 'SAL-VC' zu erstellen.
    2. Verwenden Sie das CytoHubba-Plug-in, um die Top 10 Hub-Gene basierend auf Berechnungen der maximalen Clique Centrality (MCC), der Maximum Neighborhood Component (MNC) und des Grades zu identifizieren und eine Hub-Gene-Spektrumkarte zu erstellen.
  6. Analyse der Anreicherung des GO- und KEGG-Signalwegs
    1. Führen Sie die Gen-ID-Konversion mit DAVID durch (siehe Ergänzende Tabelle 1), und wählen Sie ENSEMBL_GENE_ID für den Gentyp 9606 für Speziesinformationen aus. Analysieren Sie die konvertierte Genliste mit Omicshare (siehe Ergänzende Tabelle 1) für die Anreicherung der GO-Funktion und des KEGG-Signalwegs, wobei die Signifikanz auf den P-Wert < 0,0518 festgelegt ist.
      HINWEIS: Die GO-Funktionsanalyse umfasst die molekulare Funktion (MF), den biologischen Prozess (BP) und die zelluläre Komponente (CC). Die KEGG-Signalweganalyse umfasst die Anreicherung des Signalwegs und die Anreicherung der Signalwegklassifizierung19. Die Ergebnisse der Anreicherungsanalyse sind in Abbildung 2 dargestellt.

2. Tierversuch

  1. Akklimatisation
    1. Akklimatisieren Sie Wistar-Ratten unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen (LSF) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass sie ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser haben, um ihre Gesundheit zu erhalten, bevor die Experimente beginnen. Führen Sie 1 Woche lang eine adaptive Fütterung durch.
  2. Modell-Etablissement
    1. Akklimatisieren Sie die Ratten an die Umgebungsbedingungen und teilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen ein: Kontrollgruppe (Strg, ND + Fahrzeug), Modellgruppe (Modell, HFD + Fahrzeug), SAL-Niedrigdosisgruppe (SAL-L, HFD + SAL 5 mg/kg), SAL-Hochdosisgruppe (SAL-H, HFD + SAL 10 mg/kg) und Simvastatin (SIM)-Gruppe (HFD + SIM 5 mg/kg).
    2. Verabreichen Sie der Strg-Gruppe während der gesamten Dauer des Experiments eine normale Diät (ND) und den übrigen Gruppen eine fettreiche Diät (HFD). Am ersten Tag der HFD-Verabreichung injizieren Sie eine subkutane Einzeldosis von 600.000 I.E./kg VD3 an alle Gruppen mit Ausnahme der Strg-Gruppe20,21. Anschließend werden in den folgenden 8 Wochen wöchentlich subkutane Injektionen von 100.000 I.E./kg VD3 verabreicht (Abbildung 3).
    3. Überwachen Sie täglich den Gesundheitszustand und das Überleben der Tiere. Beginnen Sie in der neunten Woche mit experimentellen Interventionen.
    4. Euthanasieren Sie die Tiere am Ende der Studie (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Sammeln Sie Serumproben, lassen Sie sie 30 Minuten stehen und zentrifugieren Sie, um das Serum zu isolieren (gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten20,21). Präparieren Sie das Gefäßgewebe (abdominale Aorta) und spülen Sie es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um Blut zu entfernen.
    5. Fixieren Sie einen Teil des Gewebes in 4% Paraformaldehyd für die histologische Untersuchung und lagern Sie einen anderen Teil in flüssigem Stickstoff für die molekulare Analyse.
      HINWEIS: Salidrosid vor Gebrauch mit warmem Wasser verdünnen.

3. Beurteilung der Schädigung des Gefäßgewebes mittels HE-, VK-, EVG-Färbung

HINWEIS: Gefäßgewebe (Bauchschlagader ) in 4% Paraformaldehyd fixieren, nach 48 h in Ethanol dehydriert und in Paraffin eingebettet. Schneiden Sie die eingebetteten Paraffinblöcke in 5 μm große Scheiben für die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin (HE), Elastica van Gieson (EVG) und Von Kossa (VK) und beobachten Sie die histologische Morphologie unter einem Lichtmikroskop. Die HE-Färbung wird verwendet, um Veränderungen in der Gewebemorphologie zu beurteilen. Im Gefäßgewebe weist es auf strukturelle Veränderungen in der Gefäßwand hin, einschließlich der Proliferation von glatten Muskelzellen, einer unorganisierten Zellanordnung und Entzündungen. Die EVG-Färbung visualisiert elastische und kollagene Fasern, was für die Beurteilung von elastischen Faserschäden oder den Umbau im Gefäßgewebe unerlässlich ist und zum Verständnis der Auswirkungen der Verkalkung auf die Gefäßelastizität beiträgt. Die VK-Färbung detektiert Kalkablagerungen, ein Schlüsselmerkmal der VC, und ist daher entscheidend für die Beurteilung des Ausmaßes und der Verteilung der Verkalkung im Gefäßgewebe22,23.

  1. HE-Färbung zur Erkennung von Schädigungen des Gefäßgewebes
    1. Entparaffinisierung und Rehydrierung
      1. Entparaffinisieren Sie Abschnitte in zwei Xylolwechseln für jeweils 8 min und rehydrieren Sie durch eine abgestufte Ethanolreihe (100 %, 95 %, 85 %, 75 %) für 3 min pro Schritt. Anschließend 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser spülen.
    2. Hämatoxylin-Färbung
      1. Färben Sie die Abschnitte 5-10 Minuten lang mit Hämatoxylin und waschen Sie sie, um überschüssige Flecken zu entfernen, gefolgt von einer Spülung mit fließendem Leitungswasser.
        HINWEIS: Eine helle Färbung von 5 Minuten wird empfohlen, um eine zu dunkle Färbung zu vermeiden, die die zytoplasmatische Farbe beeinträchtigen kann.
    3. Differenzierung
      1. Differenzieren Sie die Schnitte in einer Differenzierlösung für 30 s, gefolgt von zwei Spülungen in Leitungswasser für jeweils 3 min.
    4. Eosin-Gegenfärbung
      1. Legen Sie die Abschnitte 1 Minute lang in Eosin-Fleck. Nachdem Sie den überschüssigen Fleck entfernt haben, führen Sie eine schnelle Dehydrierung durch.
    5. Dehydratisierung, Klärung und Montage
      1. Für eine schnelle Dehydrierung tauchen Sie die Abschnitte jeweils 3 s lang in 75 %, 85 %, 95 % und 100 % Ethanol, gefolgt von 100 % Ethanol für 1 min.
        HINWEIS: Eine schnelle Dehydrierung wird empfohlen, da Eosin in Wasser- und Ethanolgradienten an Farbe verlieren kann.
  2. VK-Färbung für den Calciumnachweis
    1. Entparaffinisierung und Rehydrierung
      1. Führen Sie diesen Schritt nach Schritt 3.1.1 aus.
    2. Reaktion von Silbernitrat
      1. Die Partien trocken tupfen, mit einem feinen Pinsel umreißen und mit Von Kossa beizen (siehe Materialtabelle). Setzen Sie sie 4 Stunden lang ultraviolettem Licht aus und spülen Sie sie dann gründlich mit fließendem Leitungswasser ab.
    3. Gegenfärbung mit Hämatoxylin
      1. Die Abschnitte 5 min lang mit Hämatoxylin einfärben, unter fließendem Leitungswasser abspülen, differenzieren und erneut spülen, gefolgt von einer Spülung unter fließendem Leitungswasser.
    4. Eosin-Gegenfärbung
      1. Die Schnitte durch abgestuftes Ethanol dehydrieren (85 % und 95 % für jeweils 5 Minuten) und dann 5 Minuten lang mit Eosin färben.
    5. Entwässerung und Montage
      1. Die Abschnitte in Ethanolbädern (100% Ethanol I, II, III für je 5 min) entwässern und in Xylolbädern (Xylol I und II für je 5 min) klären. Montieren Sie dann die Abschnitte mit neutralem Balsam.
    6. Mikroskopische Untersuchung und Bilderfassung
      1. Untersuchen Sie die gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop und nehmen Sie Bilder für die Analyse auf.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Kalziumablagerungen braun-schwarz bis dunkelschwarz erscheinen, die Zellkerne blau sind und der Hintergrund rot ist. Bereiten Sie die Silbernitratlösung unmittelbar vor der Verwendung für die frische VK-Färbung vor.
  3. EVG-Färbung für elastische und kollagene Fasern
    1. Entparaffinisierung und Rehydrierung
      1. Behandeln Sie die Paraffinabschnitte 50 Minuten lang mit Hitze und tauchen Sie sie dann 20 Minuten lang in Xylol, um Paraffin zu entfernen. Fahren Sie fort, indem Sie die Abschnitte jeweils 5 Minuten lang einer abgestuften Ethanolserie (100 %, 95 %, 85 %, 75 %) aussetzen und abschließend 5 Minuten lang in fließendem Leitungswasser spülen.
    2. EVG-Färbung
      1. Tragen Sie die EVG-Färbelösung (siehe Materialtabelle) 10 Minuten lang auf und spülen Sie sie dann 5 s lang kurz unter fließendem Leitungswasser aus, um überschüssige Flecken zu entfernen.
      2. Tragen Sie anschließend die Verhoeff-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) für 5 Minuten auf, gefolgt von einem weiteren kurzen Spülen in fließendem Leitungswasser für 5 s. Tragen Sie die Differenzierungslösung von Verhoeff 5 s lang auf, bis die Elastinfasern deutlich sichtbar sind, und spülen Sie dann 5 s lang mit fließendem Leitungswasser ab.
        HINWEIS: Mischen Sie die Komponenten A, B und C (im Lieferumfang des im Handel erhältlichen Kits enthalten) in einem Verhältnis von 5:2:2, um die Verhoeff-Arbeitslösung vor der Verwendung vorzubereiten. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 h und füllen Sie sie bei Bedarf während des Färbeprozesses auf, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern.
    3. Entwässerung und Montage
      1. Die Abschnitte werden durch eine abgestufte Ethanolreihe (75 %, 85 %, 95 % und 100 %) für jeweils 5 s dehydriert, gefolgt von einer Klärung in zwei Xylolwechseln für jeweils 1 min. Nach einer kurzen Lufttrocknungsphase die Abschnitte mit neutralem Balsam montieren.
    4. Mikroskopische Untersuchung und Bildanalyse
      1. Untersuchen Sie die gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop, um elastische und kollagene Fasern sichtbar zu machen, und nehmen Sie Bilder für die anschließende Analyse auf.

4. Alkalische Phosphatase (ALP)-Assay

HINWEIS: Verwenden Sie ALP als Schlüsselindikator, um die Wirksamkeit von Anti-Verkalkungsbehandlungen zu bewerten.

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Das farbentwickelnde Substrat wird in eiskaltem 0,05 M pH 9,6 Karbonatpuffer auf ein Endvolumen von 2,5 mL aufgelöst.
      HINWEIS: Bereiten Sie den Puffer vor, indem Sie 1,59 g Natriumcarbonat und 2,93 g Natriumbicarbonat in 1.000 ml doppelt destilliertem Wasser auflösen.
  2. Verdünnung des Substrats
    1. Verdünnen Sie 10 μl p-Nitrophenollösung (10 mM) mit 0,05 M pH 9,6 Karbonatpuffer auf ein Endvolumen von 0,2 mL, um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen.
  3. Probenvorbereitung
    1. Homogenisieren Sie die abdominale Aorta in Lysepuffer. Zentrifugieren Sie das Homogenat (~12.000 x g für 10 min bei 4 °C) und sammeln Sie den Überstand für den Nachweis der ALP-Aktivität.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Lysepuffer frei von Phosphatase-Inhibitoren ist. Lagern Sie ausstehende Prüfmuster bei -80 °C, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
  4. Mikrotiterplattenvorbereitung für den Assay
    1. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit Leer-, Standard- und Proben-Wells vor. Geben Sie 50 μl der Standardlösung in Standard-Wells und 50 μl ausstehende Testproben in die Proben-Wells. Die Platte bei 37 °C 10 min inkubieren.
  5. Reaktionsbeendigung und Absorptionsmessung
    1. Geben Sie 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden. Messen Sie die Extinktion bei 405 nm und berechnen Sie die ALP-Aktivität auf der Grundlage von Absorptionswerten (gemäß den Anweisungen des Herstellers, siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Vertiefungen, die den Standard enthalten, oder Proben mit ALP-Aktivität zeigen unterschiedliche Gelbtöne. Die Farbe ist bis zu 2 h stabil.

5. Bestimmung des Kalziumgehalts

HINWEIS: Die Bestimmung des Kalziumgehalts ist entscheidend für die Beurteilung des Ausmaßes der Mineralisierung in biologischen Geweben.

  1. Vorbereitung des Gewebes
    1. Das Gewebe in kleine Stücke zerkleinern und in Lysepuffer homogenisieren.
  2. Probenverdünnung und Zentrifugation
    1. Verdünnen Sie das Gewebe in Lysepuffer im Verhältnis 1:10. Die Mischung homogenisieren und bei 4 °C, 12.000 x g 5 min zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand für die Analyse.
      HINWEIS: Bereiten Sie Calcium-Standardverdünnungen (0-1,0 mM) mit einer 5 mM Calcium-Standardlösung vor (siehe Materialtabelle).
  3. Plattenaufbau und Inkubation
    1. Geben Sie 50 μl Standard- oder Testproben in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 150 μl der Assay-Arbeitslösung hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Messen Sie die Extinktion bei 575 nm und erstellen Sie eine Standardkurve.
  4. Berechnung des Kalziumgehalts
    1. Berechnen Sie den Kalziumgehalt anhand der Standardkurve unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors, des Probenvolumens und des Atomgewichts des Kalziums.

6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) für inflammatorische Zytokine (IL-6, TNF-α, IL-1β)

HINWEIS: IL-6, IL-1β und TNF-α sind wichtige proinflammatorische Zytokine, die das Vorhandensein und die Schwere einer Entzündungsreaktion anzeigen. Die Messung dieser Zytokine ist wichtig, um den Entzündungsprozess zu verstehen und die Wirksamkeit entzündungshemmender Behandlungen zu bewerten.

  1. Musterkollektion
    1. Sammle Serum aus der Bauchschlagader der Ratte. Lassen Sie es 2 h bei Raumtemperatur gerinnen. Die Probe bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen.
  2. Vorbereitung der Mikrotiterplatten für den Assay
    1. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit Wells vor, die für Standards und Testproben vorgesehen sind. Geben Sie 50 μl Standards (siehe Materialtabelle) in unterschiedlichen Konzentrationen in die entsprechenden Vertiefungen.
  3. Probenvorbereitung
    1. Geben Sie 40 μl Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung, die für die Testproben vorgesehen ist. Geben Sie 10 μl der Probe in die gleichen Vertiefungen, was zu einer 5-fachen Verdünnung führt.
  4. Inkubation mit enzymmarkierten Reagenzien
    1. Geben Sie 100 μl enzymmarkierte Reagenzien, die spezifisch für IL-6, TNF-α oder IL-1β sind, in alle Vertiefungen mit Ausnahme des Blindwerts. Die Platte bei 37 °C 60 min inkubieren.
  5. Waschen
    1. Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus allen Vertiefungen außer dem Rohling. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1x Waschlösung (hergestellt als 20-fache Verdünnung in destilliertem Wasser). Wiederholen Sie diesen Waschschritt fünfmal und trocknen Sie die Vertiefungen.
  6. Farbentwicklung und -beendigung
    1. Geben Sie 50 μl der Substratlösungen A und B (aus dem im Handel erhältlichen Kit, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und die Platte bei 37 °C im Dunkeln 15 min inkubieren. Geben Sie 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden.
  7. Absorptionsmessung und Datenanalyse
    1. Setzen Sie den leeren Bereich auf Null. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Generieren Sie eine Standardkurve basierend auf den OD-Werten und Standardkonzentrationen. Berechnen Sie die Probenkonzentrationen durch Interpolation und passen Sie den Verdünnungsfaktor an.

7. Lipidprofil-Assay

HINWEIS: Der Lipidprofil-Assay erkennt abnormale Lipidwerte, bei denen erhöhte oder unausgeglichene Lipidspiegel das Risiko einer Gefäßverkalkung erhöhen können.

  1. Gesamtcholesterin und Triglyceride (TC und TG)
    1. Sammeln Sie Serum und bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit ausgewiesenen Wells für Blind-, Kalibrierungs- und ausstehende Testproben vor. Geben Sie 2,5 μl Serum, Kalibrierstandard oder Blindlösung in jede Vertiefung.
    2. Geben Sie 250 μl der Arbeitslösung in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und die Platte bei 37 °C 10 min inkubieren. Messen Sie die Extinktion bei 500 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
  2. Low-Density-Lipoprotein und High-Density-Lipoprotein (LDL-C und HDL-C)
    1. Sammeln Sie Serum und bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit Vertiefungen vor, die für Blind-, Kalibrierungs- und ausstehende Testproben vorgesehen sind. Geben Sie 2,5 μl Serum, Kalibrierstandard oder Blindlösung in die jeweiligen Wells.
    2. Geben Sie das entsprechende Reagenz (Reagenz eins für 180 μl oder Reagenz zwei für 60 μl, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung, wie in den Anweisungen des Assay-Kits angegeben. Inkubieren Sie bei der Temperatur (37 °C) und für die für jedes Reagenz empfohlene Zeit (Reagenz eins für 5 min oder Reagenz zwei für 10 min).
    3. Messen Sie die Extinktion bei der spezifischen Wellenlänge (600 nm), die für LDL-C oder HDL-C angegeben ist, mit einem Mikroplatten-Reader.

8. Westliche Blotting

HINWEIS: Der Western Blot (WB) ist maßgeblich an der Beurteilung der Expressionsniveaus von Schlüsselproteinen beteiligt und ermöglicht den Nachweis sowohl der Gesamt- als auch der phosphorylierten Form.

  1. Vorbereitung des Gewebes
    1. Wiegen Sie 0,05 g Taschentuch und spülen Sie es gründlich mit PBS aus, um überschüssige Ablagerungen zu entfernen. Fügen Sie 500 μl Lysepuffer hinzu, der 1x Phosphatase und Proteaseinhibitoren enthält. Inkubieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei 4 °C und homogenisieren Sie es mit einer Gewebeschleifmaschine.
  2. Protein-Extraktion
    1. Lassen Sie die homogenisierte Probe 1 Minute lang stehen, zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 x g . Sammeln Sie den Überstand für die Proteinanalyse. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine Standardkurve, um die Konzentration zu berechnen.
      HINWEIS: Kühlen Sie die Zentrifuge vor Gebrauch auf 4 °C vor. Messen Sie die Proteinkonzentration bei 562 nm.
  3. Probenvorbereitung
    1. Mischen Sie die Proteinprobe mit 5x Ladepuffer, der β-Mercaptoethanol und SDS im Verhältnis 4:1 enthält. Die Mischung 5 min bei 100 °C erhitzen, um die Proteine zu denaturieren.
      HINWEIS: Wenn 1x Ladepuffer benötigt wird, verdünnen Sie den 5x Puffer mit Lysepuffer.
  4. SDS-PAGE Gel-Vorbereitung
    1. Bereiten Sie ein 12%iges SDS-PAGE-Gel vor und geben Sie es in das Elektrophoresegerät. Geben Sie 1x Elektrophoresepuffer bis zur Hälfte der Strecke gemäß den Anweisungen hinzu (siehe Ergänzende Tabelle 2).
  5. Elektrophorese
    1. Entnehmen Sie die Proteinproben aus einer Temperatur von -20 °C. Laden Sie 60 μg Protein pro Vertiefung und lassen Sie das Gel laufen.
    2. Stellen Sie den Strom für das Stapelgel für 20 min auf 50 mA ein und erhöhen Sie ihn dann für das Trenngel für 60 min auf 100 mA, bis die Farbstofffront den Boden erreicht.
  6. Membran-Transfer
    1. Aktivieren Sie die PVDF-Membran in Methanol für 5 min.
    2. Montieren Sie das Transfersandwich in der folgenden Reihenfolge: Filterpapier → SDS-PAGE-Gel → PVDF-Membran → Filterpapier. Übertragen Sie Proteine bei 300 mA für 60 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem SDS-PAGE-Gel und der PVDF-Membran eingeschlossen sind.
  7. Blockierend
    1. Inkubieren Sie die PVDF-Membran in 5% BSA (hergestellt in 1x TBST) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 60 min. Waschen Sie die Membran dreimal für je 5 min mit 1x TBST.
  8. Inkubation von Primärantikörpern
    1. Die Membran wird in 5 ml des entsprechenden Primärantikörpers (z. B. p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) in einem Blockierungspuffer bei Raumtemperatur für 2,5 h inkubiert.
  9. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Waschen Sie die Membran nach der Primärantikörper-Inkubation dreimal für jeweils 5 min mit 1x TBST. Mit dem entsprechenden Sekundärantikörper 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Bahn nochmals dreimal für je 5 min mit 1x TBST.
  10. Erkennung
    1. Visualisierung von Proteinbanden mit ECL-Chemilumineszenzdetektion24 (siehe Materialtabelle).
  11. Densitometrie-Analyse
    1. Quantifizieren Sie Proteinbanden mit der ImageJ-Software. Befolgen Sie diesen Arbeitsablauf in ImageJ: Image → 8-Bit-→ Prozess → Hintergrund subtrahieren. Analysieren → Einstellen von Messungen → Analysieren → Festlegen des Maßstabs. Bearbeiten → Invertieren → Analysieren → Messen → Ergebnisse. Datei → Speichern unter → IntDen.
    2. Erstellen Sie statistische Diagramme mit Hilfe von Grafik- und statistischer Analysesoftware.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse über alle Replikate hinweg konsistent sind, um die Ergebnisse zu validieren.

9. Statistische Auswertung

  1. Sammeln und organisieren Sie Daten mit GraphPad Prism 9.0.
  2. Berechnen und Darstellen von Fehlerbalken unter Verwendung von mittleren ± SD aus Rohdaten.
  3. Führen Sie eine statistische Analyse mit einer unidirektionalen ANOVA durch, gefolgt von dem Post-hoc-Test von Tukey für mehrere Vergleiche.
  4. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz bei P < 0,05, wobei kleinere P-Werte auf größere Unterschiede in den Ergebnissen hinweisen.

Ergebnisse

Netzwerkpharmakologische Analyse

Mit Hilfe von Datenbanken wie HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA und STASH wurden 388 potenzielle Zielgene für Salidrosid identifiziert. Darüber hinaus wurden 2871 potenzielle Zielgene im Zusammenhang mit VC aus Datenbanken wie GeneCards, OMIM, PharmGkb und DrugBank abgerufen. Die Schnittpunktanalyse mit Hilfe von VINN-Diagrammen ergab 208 überlappende Ziele, die als S...

Diskussion

VC ist gekennzeichnet durch degenerative Veränderungen der Gefäßzellen und -gewebe, wobei pathologische Mineralablagerungen in den Blutgefäßen zu einer Versteifung der Gefäßwände oder zur Bildung von atherosklerotischen Plaques führen, die zu obstruktiven Gefäßerkrankungen führen können25. Studien zeigen, dass sich etwa 85 % der VC-Plaques zu Thrombosen entwickeln können, die akute kardiovaskuläre Episoden auslösen können. Darüber hinaus ist VC e...

Offenlegungen

Stellen Sie sicher, dass alle Autoren alle Interessenkonflikte offengelegt haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch das Projekt des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie der Provinz Jilin (YDZJ202301ZYTS460) und das Projekt des Bildungsministeriums der Provinz Jilin (JJKH20230991KJ).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
30% (29:1) Acrylamide/Bis SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaA1010
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0099
5*loading bufferBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaP1040
Alkaline Phosphatase Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0321S
AlphaView SoftwareProteinsimple Inc.USAAlphaView SA
BCA Protein Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0012
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1866
Calcium Colorimetric Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaS1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1597
Dewatering machineDiapath Biosciences  Ltd, ItalyDonatello
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., Ltd,ChinaJB-P5
Enzyme-labeled instrument Biotek Co., Ltd,USAEpoch
Ethanol absoluteGHTECH  Co., Ltd, China64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRPBioworld technology, co, Ltd.,ChinaBS20242-Y
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software.,USAGraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain KitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Guangzhou saiguo biotech Co.,LTDA0208
Image J SoftwareNational Institutes of Health(NIH),USAImage J 
IκB Alpha Polyclonal antibodyProteintech Group, Inc.A,USA10268-1-AP
JAK2 AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA113
NF-κB p65 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10745-1-AP
Pathological microtomeLeica Biosystems,USARM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail TablesF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF2006
Phospho-STAT3(S727) AntibodyAbways  Science & Technology Co., Ltd ,ChinaCY5291
Protease Inhibitor Cocktail F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland11873580001
PVDF membraneF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland3010040001
Rat IL-1β ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI328
Rat TNF-α ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPT516
RIPA Lysis BufferBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0013B
SalisorosideShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,ChinaS25475
SDSGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China3250KG001
Sodium carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China1001921933
Sodium hydrogen carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China10018960
Sodium thiosulfateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China20042518
STAT3 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10253-2-AP
TBST (10×)Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaST673
Total cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA111
Triglyceride assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA110
Tris BaseGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD1115GR500
Upright optical microscopeNikon Corporation,JapanEclipse E100
Von Kossa Solution Wuhan servicebio technology CO.,LTD,ChinaG1043
Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz Biotechnology, Inc. ,USASC-2048
β-Actin antibody Cell Signaling Technology, Inc.,USAE4967

Referenzen

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