Avaliação do Salidroside como Agente Terapêutico para Calcificação Vascular Usando Farmacologia de Rede e Modelos Experimentais de Rato

Resumo

Este estudo estabelece um modelo de rata de calcificação vascular induzida por uma dieta hiperlipídica (HFD) combinada com vitamina D3 (VD3). O modelo foi usado para avaliar a eficácia terapêutica do salidrosídeo na prevenção e tratamento da calcificação vascular, fornecendo informações sobre seus potenciais mecanismos de ação por meio da farmacologia em rede e experimentos in vivo .

Resumo

A calcificação vascular (CV) é uma condição patológica crítica associada a morbidade e mortalidade significativas. Este estudo emprega uma abordagem híbrida de farmacologia de rede e biologia molecular para delinear os mecanismos terapêuticos do salidrosídeo (SAL), um composto ativo de Rhodiola crenulata, contra a CV. Por meio de mineração de banco de dados e análise de rede, foram identificados 388 alvos SAL que se cruzam com 2871 alvos associados ao VC, resultando em 208 alvos comuns. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) construída por meio do banco de dados String e análise topológica no Cytoscape 3.9.1 identificou 10 alvos principais, incluindo IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 e STAT3, entre outros. Os genes identificados estavam concentrados nas vias lipídicas e aterosclerose, indicando que a melhora da CV por SAL pode ocorrer através da regulação da expressão anormal de fatores lipídicos e inflamatórios. Verificou-se também que o SAL inibe a expressão anormal de fatores inflamatórios, ativando assim a via JAK2/STAT3 para intervir na progressão da CV. A via JAK2 / STAT3 é um mecanismo molecular chave pelo qual o SAL previne a deterioração adicional da CV. As análises de enriquecimento funcional revelaram o envolvimento desses alvos nas respostas inflamatórias e no metabolismo lipídico, vias fundamentais na CV. Estudos in vivo em ratos demonstraram a eficácia do SAL na mitigação da dislipidemia e inflamação vascular, com melhora dos perfis lipídicos séricos e redução da deposição de cálcio vascular. A exploração mecanicista, fundamentada na análise de Western blot, demonstrou a capacidade do salidrosídeo de regular a via de sinalização JAK2 / STAT3, destacando seu potencial como modulador neste mecanismo molecular crítico e oferecendo um potencial alvo terapêutico para CV. A força desta pesquisa reside em seu rigor metodológico, integrando previsões computacionais com validações in vivo . Essa abordagem abrangente estabelece uma estrutura robusta para explorar os mecanismos terapêuticos de compostos naturais no combate ao CV.

Introdução

A calcificação vascular (CV) refere-se à deposição anormal de cálcio dentro das paredes dos vasos, o que leva ao enrijecimento arterial e diminuição da elasticidade, prejudicando a função vascular. Tradicionalmente, a CV tem sido dividida em dois tipos: calcificação intimal, ligada ao acúmulo de lipídios, e calcificação medial. O primeiro está intimamente associado à infiltração inflamatória, desencadeando uma transformação osteogênica na parede vascular, caracterizada pela migração, proliferação e diferenciação de células musculares lisas vasculares (VSMCs) em células semelhantes a osteoblastos¹.

A capacidade dos VSMCs de sofrer diferenciação osteogênica, influenciada por fatores como envelhecimento, genética e condições ambientais como diabetes e doença renal crônica, é um dos principais contribuintes para a CV relacionada à idade. Essa transformação semelhante a osteoblastos exacerba a calcificação e degeneração arterial¹.

A CV é uma condição multifacetada, impulsionada por alterações degenerativas, desequilíbrios metabólicos e várias condições sistêmicas. Aproximadamente 80% das lesões vasculares e 90% dos casos de doença arterial coronariana apresentam CV, aumentando significativamente o risco de eventos cardiovasculares graves ^1,2. Portanto, há uma necessidade premente de descobrir tratamentos farmacológicos que efetivamente mitiguem ou revertam essa condição.

Atualmente, as estratégias de tratamento para CV envolvem várias intervenções farmacológicas, embora nenhum medicamento seja projetado especificamente para esse fim. Para pacientes com calcificação leve, as estatinas são frequentemente prescritas para estabilizar as placas. No entanto, embora possam reduzir a estenose da artéria coronária diminuindo os níveis lipídicos, seu efeito sobre a calcificação é limitado².

Dadas as complexidades da aterosclerose, muitos pacientes apresentam ativação plaquetária aumentada, necessitando do uso de medicamentos antiplaquetários como aspirina ou clopidogrel para inibir a agregação plaquetária e reduzir o risco de trombose. No entanto, a terapia com aspirina só é benéfica para indivíduos com alto escore de cálcio na artéria coronária e baixo risco de sangramento³.

Além disso, pesquisas sobre suplementos, como a vitamina K, sugerem potencial na prevenção da progressão da CV⁴. Em casos graves, intervenções invasivas podem ser consideradas, embora muitas vezes sejam inadequadas para CV generalizada⁵. Para indivíduos sem CV existente, o gerenciamento de fatores de risco, como pressão arterial, perfis lipídicos e escolhas de estilo de vida, continua sendo crítico⁶.

Rhodiola crenulata, uma erva perene da família Crassulaceae, tem sido tradicionalmente utilizada na medicina chinesa. Seu principal constituinte bioativo, o salidrosídeo, chama atenção significativa devido às suas notáveis atividades biológicas. O salidrosídeo é conhecido por sua capacidade de inibir a apoptose, exibir propriedades antioxidantes robustas e possuir características anti-inflamatórias ^7,8. Esses atributos contribuem para seu potencial de melhorar a função vascular, retardar o envelhecimento vascular e proteger o endotélio vascular. Como um potencial agente terapêutico para CV, o salidroside tem um valor substancial para a pesquisa. No entanto, os mecanismos precisos pelos quais o salidrosídeo melhora a CV ainda precisam ser totalmente elucidados e justificam uma investigação mais aprofundada para aproveitar seu potencial terapêutico no tratamento da CV.

Para explorar esses mecanismos, este estudo utiliza a farmacologia de rede, uma metodologia inovadora que combina farmacologia, bioinformática e ciência da computação para analisar sistemas biológicos e elucidar mecanismos de drogas. Em comparação com a pesquisa tradicional de medicamentos de alvo único, a farmacologia de rede oferece uma abordagem mais abrangente, analisando os efeitos de um medicamento em vários alvos biológicos e vias de sinalização. Como uma ferramenta fundamental no desenvolvimento de medicamentos modernos, ele constrói redes de medicamentos, alvos e vias para revelar os mecanismos subjacentes da ação do medicamento ^9,10. Apesar de seu uso extensivo na exploração de mecanismos terapêuticos, tem havido pesquisas limitadas sobre os mecanismos interativos entre o salidrosídeo e o VC nas perspectivas da bioinformática e da farmacologia de redes.

Esta pesquisa constrói um mapa de rede molecular do impacto potencial do salidroside no VC, identificando e analisando os principais alvos por meio de extensa mineração de banco de dados. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) é gerada e a análise topológica é aplicada para destacar nós críticos no processo de calcificação.

Para confirmar as previsões computacionais, um modelo de VC em ratos é desenvolvido administrando uma dieta rica em gordura com vitamina D3 (VD3). Este modelo replica as características patológicas da CV humana. A lesão vascular é avaliada por meio de técnicas histológicas, os perfis lipídicos séricos e os marcadores de inflamação são avaliados para investigar os efeitos sistêmicos do salidrosídeo, e a expressão de proteínas relacionadas ao anti-VC SAL é medida usando Western blotting para explorar o impacto do salidrosídeo no CV induzido experimentalmente, este estudo visa contribuir com informações valiosas sobre o potencial deste composto como estratégia terapêutica para combater o CV.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (Aprovação nº 2023091). Este estudo segue as diretrizes internacionais, incluindo as Diretrizes da Comunidade Européia e a Diretiva CEE de 1986, garantindo o tratamento ético dos animais durante todo o estudo. Ratos Wistar machos (8-10 semanas, peso 200-220 g) foram usados para o estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Previsão farmacológica de rede de potenciais alvos de salidroside-VC

NOTA: A farmacologia de rede utiliza métodos computacionais e análise de dados em larga escala para investigar as complexas interações entre moléculas de medicamentos e alvos biológicos, como vias, genes e proteínas dentro de um organismo^11,12. Essa abordagem ajuda a decifrar as funções biológicas e as relações das entidades estudadas. A metodologia engloba a utilização de banco de dados, processamento de informações químicas, aquisição de dados de bioatividade, recuperação de dados de proteínas, análise de perfis de expressão gênica, construção de redes de interação e análise de enriquecimento de vias¹¹. A Figura 1 mostra a rede de interação dos alvos centrais entre o salidrosídeo e a calcificação vascular.

1. Construção do banco de dados de destino "Ingrediente"
   1. Use "Salidroside" como a palavra-chave para ingredientes para pesquisar bancos de dados¹³ (consulte a Tabela Suplementar 1), como HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA e STITCH.
   2. Revise a literatura relevante para identificar alvos associados ao salidroside, com a espécie definida para Homo sapiens. Depois de remover as duplicatas, padronize as proteínas-alvo usando UniProt (consulte a Tabela Suplementar 1) e estabeleça um banco de dados abrangente de alvos de Salidroside¹⁴.
2. Construção do banco de dados de alvos "Doenças"
   1. Use "calcificação vascular" como palavra-chave para pesquisar bancos de dados¹⁵ (consulte a Tabela Suplementar 1), incluindo GeneCards, OMIM, PharmGkb e DrugBank, com as espécies definidas como Homo sapiens. Após a eliminação da duplicação, crie um banco de dados de alvos de calcificação vascular.
3. Previsão de potenciais alvos terapêuticos
   1. Insira os alvos para salidroside e calcificação vascular (consulte a Tabela Suplementar 1) para identificar alvos comuns. Gere um diagrama de Venn para visualizar os potenciais alvos terapêuticos do salidroside no tratamento da calcificação vascular.
4. Construção da rede de Interação Proteína-Proteína (IBP) "Salidrosídeo-Calcificação Vascular"
   1. Compile os alvos potenciais em uma Lista de Proteínas Múltiplas e analise-os usando STRING (ver Tabela Suplementar 1), com o organismo definido como Homo sapiens e a pontuação de interação definida como confiança média (>0,4)¹⁶. Extraia os dados do PPI no formato TSV para análise posterior.
      NOTA: Dado que 85% dos genes de ratos são homólogos aos genes humanos, desempenhando funções biológicas semelhantes, os ratos foram selecionados como sujeitos experimentais para validar os efeitos do salidrosídeo na calcificação vascular¹⁷.
5. Seleção e construção de rede de alvos-chave
   1. Importe os dados da rede PPI para o Cytoscape 3.9.1 (consulte a Tabela Suplementar 1) para análise usando o plug-in CytoNCA para avaliar parâmetros como Intermediação (BC), Proximidade (CC), Grau (DC), Vetor Próprio (EC), Conectividade Média Local (LAC) e Centralidade de Rede (NC). Selecione os principais alvos com CC=1 para construir um mapa do espectro de ação do alvo principal para 'SAL-VC'.
   2. Use o plug-in CytoHubba para identificar os 10 principais genes do hub com base nos cálculos de Centralidade Máxima de Clique (MCC), Componente Máximo de Vizinhança (MNC) e Grau, gerando um mapa de espectro de genes Hub.
6. Análise de enriquecimento das vias GO e KEGG
   1. Execute a conversão de ID de gene usando DAVID (consulte a Tabela Suplementar 1), selecionando ENSEMBL_GENE_ID para o tipo de gene-9606 para obter informações sobre a espécie. Analise a lista de genes convertidos usando Omicshare (ver Tabela Suplementar 1) para enriquecimento funcional da via GO e KEGG, com significância definida no valor P < 0,05¹⁸.
      NOTA: A análise funcional GO inclui função molecular (MF), processo biológico (BP) e componente celular (CC). A análise da via KEGG envolve o enriquecimento da via e o enriquecimento da classificação da via¹⁹. Os resultados da análise de enriquecimento são representados na Figura 2.

2. Experiência animal

1. Aclimatação
   1. Aclimatar ratos Wistar em condições específicas livres de patógenos (FPS) com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Certifique-se de que eles tenham acesso ad libitum a alimentos e água para manter sua saúde antes do início dos experimentos. Realize a alimentação adaptativa por 1 semana.
2. Estabelecimento modelo
   1. Aclimatar os ratos às condições ambientais e distribuí-los aleatoriamente em cinco grupos: Grupo Controle (Ctrl, ND + Veículo), Grupo Modelo (Modelo, HFD + Veículo), Grupo SAL de baixa dose (SAL-L, HFD + SAL 5mg/kg), Grupo de alta dose de SAL (SAL-H, HFD + SAL 10mg/kg) e Grupo Sinvastatina (SIM) (HFD + SIM 5mg/kg).
   2. Administre uma dieta normal (ND) ao grupo Ctrl e uma dieta rica em gordura (HFD) aos grupos restantes durante toda a duração do experimento. No primeiro dia de administração de HFD, injetar uma dose única subcutânea de 600.000 UI/kg VD3 em todos os grupos, exceto no grupo Ctrl^20,21. Siga com injeções subcutâneas semanais de 100.000 UI / kg VD3 nas 8 semanas seguintes (Figura 3).
   3. Monitore diariamente o estado de saúde e a sobrevivência dos animais. Comece as intervenções experimentais na nona semana.
   4. Eutanásia dos animais na conclusão do estudo (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente). Colete amostras de soro, deixe-as repousar por 30 min e centrifugue para isolar o soro (seguindo relatórios publicados anteriormente^20,21). Disseque os tecidos vasculares (aorta abdominal) e enxágue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue.
   5. Fixe uma porção do tecido em paraformaldeído a 4% para exame histológico e armazene outra porção em nitrogênio líquido para análise molecular.
      NOTA: Dilua o salidroside com água morna antes de usar.

3. Avaliação da lesão tecidual vascular usando coloração HE, VK, EVG

NOTA: Fixar o tecido vascular (aorta abdominal) em paraformaldeído a 4%, desidratado em etanol após 48 h e embebido em parafina. Corte os blocos de parafina embebidos em fatias de 5 μm para coloração de hematoxilina-eosina (HE), Elastica van Gieson (EVG) e Von Kossa (VK) e observe a morfologia histológica ao microscópio óptico. A coloração HE é usada para avaliar alterações na morfologia do tecido. No tecido vascular, destaca alterações estruturais na parede do vaso, incluindo proliferação de células musculares lisas, arranjo celular desorganizado e inflamação. A coloração EVG visualiza fibras elásticas e colágenas, o que é essencial para avaliar o dano ou remodelação das fibras elásticas no tecido vascular e ajuda a entender o impacto da calcificação na elasticidade vascular. A coloração VK detecta depósitos de cálcio, uma característica fundamental na CV, tornando-a crucial para avaliar a extensão e a distribuição da calcificação no tecido vascular^22,23.

1. Coloração HE para detecção de danos ao tecido vascular
   1. Desparafinização e reidratação
      1. Desparafinizar seções em duas trocas de xileno por 8 min cada e reidratar através de uma série graduada de etanol (100%, 95%, 85%, 75%) por 3 min por etapa. Em seguida, enxágue por 2 minutos em água corrente da torneira.
   2. Coloração de hematoxilina
      1. Pinte as seções com hematoxilina por 5-10 min e lave para remover o excesso de mancha, seguido de um enxágue com água corrente da torneira.
         NOTA: Recomenda-se uma coloração leve de 5 min para evitar manchas excessivamente escuras, que podem afetar a cor citoplasmática.
   3. Diferenciação
      1. Diferencie as seções em uma solução de diferenciação por 30 s, seguida de dois enxágues em água da torneira por 3 min cada.
   4. Contracoloração de eosina
      1. Coloque as seções na coloração de eosina por 1 min. Depois de remover o excesso de mancha, faça uma desidratação rápida.
   5. Desidratação, clarificação e montagem
      1. Para desidratação rápida, mergulhe as seções em etanol a 75%, 85%, 95% e 100% por 3 s cada, seguido de etanol a 100% por 1 min.
         NOTA: Recomenda-se a desidratação rápida, pois a eosina pode perder a cor em gradientes de água e etanol.
2. Coloração VK para detecção de cálcio
   1. Desparafinização e reidratação
      1. Execute esta etapa seguindo a etapa 3.1.1.
   2. Reação de nitrato de prata
      1. Seque as seques, contorne com um pincel fino e pinte com Von Kossa (consulte a Tabela de Materiais). Exponha-os à luz ultravioleta por 4 h e depois enxágue abundantemente com água corrente da torneira.
   3. Contracoloração com hematoxilina
      1. Pinte as seções com hematoxilina por 5 min, enxágue em água corrente da torneira, diferencie e enxágue novamente, seguido de um enxágue com água corrente da torneira.
   4. Contracoloração de eosina
      1. Desidrate as seções com etanol graduado (85% e 95% por 5 min cada) e depois cove com eosina por 5 min.
   5. Desidratação e montagem
      1. Desidrate as seções em banhos de etanol (100% Etanol I, II, III por 5 min cada) e clareie em banhos de xileno (Xileno I e II por 5 min cada). Em seguida, monte as seções com bálsamo neutro.
   6. Exame microscópico e captura de imagem
      1. Examine as seções coradas sob um microscópio óptico e capture imagens para análise.
         NOTA: Certifique-se de que os depósitos de cálcio pareçam marrom-pretos a pretos escuros, os núcleos sejam azuis e o fundo seja vermelho. Prepare a solução de nitrato de prata para coloração VK fresca imediatamente antes do uso.
3. Coloração EVG para fibras elásticas e colágenas
   1. Desparafinização e reidratação
      1. Trate as seções de parafina com calor por 50 min e, em seguida, mergulhe-as em xileno por 20 min para remover a parafina. Proceda submetendo as seções a uma série graduada de etanol (100%, 95%, 85%, 75%) por 5 min cada, concluindo com um enxágue em água corrente da torneira por 5 min.
   2. Coloração EVG
      1. Aplique a solução de coloração EVG (consulte a Tabela de Materiais) por 10 min e, em seguida, enxágue brevemente em água corrente da torneira por 5 s para remover o excesso de mancha.
      2. Em seguida, aplique a solução de trabalho de Verhoeff (consulte a Tabela de Materiais) por 5 min, seguido de outro breve enxágue em água corrente da torneira por 5 s. Aplique a solução diferenciadora de Verhoeff por 5 s até que as fibras de elastina estejam claramente visíveis e, em seguida, enxágue com água corrente da torneira por 5 s.
         NOTA: Misture os componentes A, B e C (fornecidos no kit disponível comercialmente) na proporção de 5:2:2 para preparar a solução de trabalho Verhoeff antes de usar. Use a solução dentro de 2 h e reabasteça conforme necessário durante o processo de coloração para evitar que as seções sequem.
   3. Desidratação e montagem
      1. Desidratar as seções por meio de uma série graduada de etanol (75%, 85%, 95% e 100%) por 5 s cada, seguida de uma clarificação em duas trocas de xileno por 1 min cada. Após um breve período de secagem ao ar, monte as seções com bálsamo neutro.
   4. Exame microscópico e análise de imagem
      1. Examine as seções coradas sob um microscópio óptico para visualizar fibras elásticas e colágenas e capture imagens para análise subsequente.

4. Ensaio de fosfatase alcalina (ALP)

NOTA: Use o ALP como um indicador-chave para avaliar a eficácia dos tratamentos anticalcificação.

1. Preparação de reagentes
   1. Dissolva o substrato de desenvolvimento de cor em tampão de carbonato de pH 9,6 0,05 M gelado até um volume final de 2,5 mL.
      NOTA: Prepare o tampão dissolvendo 1,59 g de carbonato de sódio e 2,93 g de bicarbonato de sódio em 1.000 mL de água bidestilada
2. Diluição do substrato
   1. Diluir 10 μL de solução de p-nitrofenol (10 mM) com tampão de carbonato pH 9,6 0,05 M até um volume final de 0,2 mL para atingir uma concentração final de 0,5 mM.
3. Preparação da amostra
   1. Homogeneizar a aorta abdominal em tampão de lise. Centrifugar o homogeneizado (~12.000 x g durante 10 min a 4 °C) e recolher o sobrenadante para detecção da actividade ALP.
      NOTA: Certifique-se de que o tampão de lise esteja livre de inibidores de fosfatase. Armazene amostras de teste pendentes a -80 °C, evitando ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
4. Preparação de microplacas para ensaio
   1. Prepare uma placa de 96 poços com poços em branco, padrão e de amostra. Adicione 50 μL da solução padrão aos poços padrão e 50 μL de amostras de teste pendentes aos poços de amostragem. Incubar a placa a 37 °C durante 10 min.
5. Terminação de reação e medição de absorbância
   1. Adicione 100 μL de solução de parada a cada poço para encerrar a reação. Meça a absorbância a 405 nm e calcule a atividade ALP com base nos valores de absorbância (seguindo as instruções do fabricante, consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Os poços contendo o padrão ou amostras com atividade ALP mostrarão vários tons de amarelo. A cor é estável por até 2 h.

5. Determinação do teor de cálcio

NOTA: A determinação do teor de cálcio é fundamental para avaliar a extensão da mineralização nos tecidos biológicos.

1. Preparação de tecidos
   1. Pique o tecido em pedaços pequenos e homogeneize em tampão de lise.
2. Diluição e centrifugação da amostra
   1. Diluir o tecido em tampão de lise na proporção de 1:10. Homogeneizar a mistura e centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 5 min. Colete o sobrenadante para análise.
      NOTA: Prepare diluições padrão de cálcio (0-1.0 mM) usando uma solução padrão de cálcio 5 mM (consulte a Tabela de Materiais).
3. Configuração e incubação da placa
   1. Adicione 50 μL de amostras padrão ou de teste a cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione 150 μL de solução de trabalho de ensaio, misture bem e incube a placa no escuro em temperatura ambiente por 10 min. Medir a absorvância a 575 nm e construir uma curva padrão.
4. Cálculo do teor de cálcio
   1. Calcular o teor de cálcio utilizando a curva-padrão, incorporando o factor de diluição, o volume da amostra e o peso atómico do cálcio.

6. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-α, IL-1β)

NOTA: IL-6, IL-1β e TNF-α são citocinas pró-inflamatórias essenciais que indicam a presença e a gravidade de uma resposta inflamatória. A medição dessas citocinas é essencial para entender o processo inflamatório e avaliar a eficácia dos tratamentos anti-inflamatórios.

1. Coleta de amostras
   1. Colete soro da aorta abdominal do rato. Deixe coagular à temperatura ambiente por 2 h. Centrifugar a amostra a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C e recolher o sobrenadante.
2. Preparação de microplacas para o ensaio
   1. Prepare uma placa de 96 poços com poços designados para padrões e amostras de teste. Adicione 50 μL de padrões (consulte a Tabela de Materiais) em concentrações variadas aos poços apropriados.
3. Preparação da amostra
   1. Adicione 40 μL de diluente de amostra a cada poço designado para amostras de teste. Adicione 10 μL da amostra aos mesmos poços, resultando em uma diluição de 5 vezes.
4. Incubação com reagentes marcados com enzimas
   1. Adicione 100 μL de reagentes marcados com enzimas específicos para IL-6, TNF-α ou IL-1β a todos os poços, exceto o branco. Incubar a placa a 37 °C durante 60 min.
5. Lavagem
   1. Descarte o líquido de todos os poços, exceto o branco. Lave os poços com 1x solução de lavagem (preparada como uma diluição de 20 vezes em água destilada). Repita esta etapa de lavagem cinco vezes e seque os poços.
6. Desenvolvimento e terminação de cores
   1. Adicione 50 μL de soluções de substrato A e B (do kit disponível comercialmente, consulte a Tabela de Materiais) a cada poço. Misture delicadamente e incube a placa a 37 °C no escuro por 15 min. Adicione 50 μL de solução de parada a cada poço para encerrar a reação.
7. Medição de absorbância e análise de dados
   1. Defina o poço em branco como zero. Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Gere uma curva padrão com base nos valores de OD e concentrações padrão. Calcular as concentrações da amostra por interpolação e ajustar o factor de diluição.

7. Ensaio do perfil lipídico

NOTA: O ensaio de perfil lipídico detecta níveis lipídicos anormais, onde níveis lipídicos elevados ou desequilibrados podem acelerar o risco de calcificação vascular.

1. Colesterol total e triglicerídeos (CT e TG)
   1. Colete o soro e prepare uma placa de 96 poços com poços designados para amostras em branco, calibração e teste pendente. Adicione 2,5 μL de soro, padrão de calibração ou solução em branco a cada poço.
   2. Adicione 250 μL da solução de trabalho a cada poço. Misturar delicadamente e incubar a placa a 37 °C durante 10 min. Medir a absorvância a 500 nm utilizando um leitor de microplacas.
2. Lipoproteína de baixa densidade e lipoproteína de alta densidade (LDL-C e HDL-C)
   1. Colete o soro e prepare uma placa de 96 poços com poços designados para amostras de teste em branco, calibração e pendentes. Adicione 2,5 μL de soro, padrão de calibração ou solução em branco aos respectivos poços.
   2. Adicione o reagente apropriado (Reagente Um para 180 μL ou Reagente Dois para 60 μL, consulte a Tabela de Materiais) a cada poço, conforme especificado nas instruções do kit de ensaio. Incubar à temperatura (37 °C) e durante o tempo (Reagente Um durante 5 min ou Reagente Dois durante 10 min) recomendado para cada reagente.
   3. Medir a absorvância no comprimento de onda específico (600 nm) indicado para o LDL-C ou o HDL-C utilizando um leitor de microplacas.

8. Western blotting

NOTA: O Western blot (WB) é fundamental na avaliação dos níveis de expressão de proteínas-chave, permitindo a detecção de formas totais e fosforiladas.

1. Preparação de tecidos
   1. Pesar 0,05 g de lenço de papel e enxaguar abundantemente com PBS para remover o excesso de detritos. Adicione 500 μL de tampão de lise contendo 1x inibidores de fosfatase e protease. Incubar o tecido a 4 °C por 10 min e homogeneizá-lo usando um moedor de tecidos.
2. Extração de proteínas
   1. Deixe a amostra homogeneizada repousar por 1 min e, em seguida, centrifugue a 4 °C e 12.000 x g por 15 min. Colete o sobrenadante para análise de proteínas. Determine a concentração de proteína usando o método BCA seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Use uma curva padrão para calcular a concentração.
      NOTA: Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C antes de usar. Meça a concentração de proteína a 562 nm.
3. Preparação da amostra
   1. Misture a amostra de proteína com tampão de carga 5x contendo β-mercaptoetanol e SDS na proporção de 4:1. Aqueça a mistura a 100 °C por 5 min para desnaturar as proteínas.
      NOTA: Se for necessário um buffer de carregamento de 1x, dilua o buffer de 5x com buffer de lise.
4. Preparação de gel SDS-PAGE
   1. Prepare um gel SDS-PAGE a 12% e coloque-o no aparelho de eletroforese. Adicione 1x tampão de eletroforese até a metade do caminho de acordo com as instruções (consulte a Tabela Suplementar 2).
5. Eletroforese
   1. Retirar as amostras de proteínas a -20 °C. Carregue 60 μg de proteína por poço e execute o gel.
   2. Defina a corrente para 50 mA por 20 min para o gel de empilhamento e, em seguida, aumente para 100 mA por 60 min para o gel de separação até que a frente do corante atinja o fundo.
6. Transferência de membrana
   1. Ative a membrana de PVDF em metanol por 5 min.
   2. Monte o sanduíche de transferência na seguinte ordem: papel de filtro → gel SDS-PAGE → membrana de PVDF → papel de filtro. Transfira proteínas a 300 mA por 60 min.
      NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar presas entre o gel SDS-PAGE e a membrana PVDF.
7. Bloqueio
   1. Incubar a membrana de PVDF em 5% BSA (preparada em 1x TBST) à temperatura ambiente com agitação suave durante 60 min. Lave a membrana com 1x TBST três vezes por 5 min cada.
8. Incubação primária de anticorpos
   1. Incubar a membrana em 5 ml do anticorpo primário apropriado (por exemplo, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) diluído em tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante 2,5 h.
9. Incubação secundária de anticorpos
   1. Lave a membrana com 1x TBST três vezes por 5 min cada após a incubação primária do anticorpo. Incubar com o anticorpo secundário adequado à temperatura ambiente durante 1 h. Lave a membrana novamente com 1x TBST três vezes por 5 min cada.
10. Detecção
    1. Visualize bandas de proteínas usando a detecção de quimioluminescência ECL²⁴ (consulte a Tabela de Materiais).
11. Análise de densitometria
    1. Quantifique bandas de proteínas usando o software ImageJ. Siga este fluxo de trabalho em ImageJ: Processo de → de imagem → 8 bits → Subtrair plano de fundo. Analise → defina medidas → analise → escala definida. Edite → inverta → analise → meça → resultados. Arquivo → Salvar como → IntDen.
    2. Gere gráficos estatísticos usando software de gráficos e análise estatística.
       NOTA: Certifique-se de que os resultados sejam consistentes entre as réplicas para validar as descobertas.

9. Análise estatística

1. Colete e organize dados usando o GraphPad Prism 9.0.
2. Calcule e plote barras de erro usando o SD médio ± de dados brutos.
3. Realize a análise estatística usando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas.
4. Determine a significância estatística em P < 0,05, com valores de P menores indicando maiores diferenças nos resultados.

Resultados

Análise farmacológica de rede

Usando bancos de dados como HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA e STITCH, 388 genes-alvo potenciais para o salidrosídeo foram identificados. Além disso, 2871 genes-alvo potenciais relacionados à CV foram recuperados de bancos de dados como GeneCards, OMIM, PharmGkb e DrugBank. A análise de interseção por meio de diagramas VENN revelou 208 alvos sobrepostos, considerad...

Discussão

A CV é caracterizada por alterações degenerativas nas células e tecidos vasculares, com depósitos minerais patológicos dentro dos vasos sanguíneos levando ao enrijecimento das paredes dos vasos ou à formação de placas ateroscleróticas, que podem resultar em doenças vasculares obstrutivas²⁵. Estudos mostram que cerca de 85% das placas de CV podem evoluir para trombose, o que pode desencadear episódios cardiovasculares agudos. Além disso, a CV é um in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% (29:1) Acrylamide/Bis Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	A1010
4% Paraformaldehyde Fix Solution	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0099
5*loading buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	P1040
Alkaline Phosphatase Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0321S
AlphaView Software	Proteinsimple Inc.USA	AlphaView SA
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0012
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1866
Calcium Colorimetric Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	S1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1597
Dewatering machine	Diapath Biosciences  Ltd, Italy	Donatello
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd,China	JB-P5
Enzyme-labeled instrument	Biotek Co., Ltd,USA	Epoch
Ethanol absolute	GHTECH  Co., Ltd, China	64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP	Bioworld technology, co, Ltd.,China	BS20242-Y
GraphPad Prism Software	GraphPad Software.,USA	GraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	A0208
Image J Software	National Institutes of Health(NIH),USA	Image J
IκB Alpha Polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10268-1-AP
JAK2 Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A113
NF-κB p65 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10745-1-AP
Pathological microtome	Leica Biosystems,USA	RM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail Tables	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF2006
Phospho-STAT3(S727) Antibody	Abways  Science & Technology Co., Ltd ,China	CY5291
Protease Inhibitor Cocktail	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	11873580001
PVDF membrane	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	3010040001
Rat IL-1β ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI303
Rat IL-6 ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI328
Rat TNF-α ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PT516
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0013B
Salisoroside	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,China	S25475
SDS	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China	3250KG001
Sodium carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	1001921933
Sodium hydrogen carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	10018960
Sodium thiosulfate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	20042518
STAT3 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10253-2-AP
TBST (10×)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	ST673
Total cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A111
Triglyceride assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A110
Tris Base	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	1115GR500
Upright optical microscope	Nikon Corporation,Japan	Eclipse E100
Von Kossa Solution	Wuhan servicebio technology CO.,LTD,China	G1043
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc. ,USA	SC-2048
β-Actin antibody	Cell Signaling Technology, Inc.,USA	E4967