使用网络药理学和实验大鼠模型评估红景天苷作为血管钙化的治疗剂

摘要

本研究建立了高脂饮食 （HFD） 联合维生素 D3 （VD3） 诱导血管钙化的大鼠模型。该模型用于评价红景天苷在预防和治疗血管钙化方面的治疗效果，通过网络药理学和 体内 实验深入了解其潜在作用机制。

摘要

血管钙化 （VC） 是一种与高发病率和死亡率相关的危急病理状况。本研究采用网络药理学和分子生物学的混合方法来描述红景天苷 （SAL） 对 VC 的治疗机制，这是一种来自 红景天的活性化合物。通过数据库挖掘和网络分析，确定了 388 个 SAL 靶点与 2871 个 VC 相关靶点相交，得出 208 个共同靶点。 通过 String 数据库和 Cytoscape 3.9.1 中的拓扑分析构建的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络确定了 10 个关键靶点，包括 IL6、TNF、TP53、IL1B、HIF1A、CASP3 和 STAT3 等。鉴定出的基因集中在脂质和动脉粥样硬化通路，表明 SAL 对 VC 的改善可能是通过调节脂质和炎症因子的异常表达来实现的。还发现 SAL 抑制炎症因子的异常表达，从而激活 JAK2/STAT3 通路干预 VC 的进展。JAK2/STAT3 通路是 SAL 防止 VC 进一步恶化的关键分子机制。功能富集分析揭示了这些靶点参与炎症反应和脂质代谢，这是 VC 的关键途径。大鼠 体内研究表明， SAL 在减轻血脂异常和血管炎症方面的有效性，改善了血脂水平，减少了血管钙沉积。基于蛋白质印迹分析的机制探索证明了红景天苷调节 JAK2/STAT3 信号通路的能力，突出了其作为这一关键分子机制中的调节剂的潜力，并为 VC 提供了潜在的治疗靶点。这项研究的优势在于其方法论的严谨性，将计算预测与 体内 验证相结合。这种全面的方法为探索天然化合物对抗 VC 的治疗机制建立了一个强大的框架。

引言

血管钙化 （VC） 是指钙在血管壁内异常沉积，导致动脉硬化和弹性降低，最终损害血管功能。传统上，VC 分为两种类型：内膜钙化（与脂质积聚有关）和内层钙化。前者与炎性浸润密切相关，触发血管壁的成骨转化，其特征是血管平滑肌细胞 （VSMC） 迁移、增殖和分化为成骨细胞样细胞¹。

VSMC 经历成骨分化的能力受衰老、遗传和环境条件（如糖尿病和慢性肾病）等因素的影响，是导致年龄相关性 VC 的主要因素。这种成骨细胞样转化加剧了动脉钙化和变性¹。

VC 是一种多方面的疾病，由退行性变化、代谢失衡和各种全身性疾病驱动。大约 80% 的血管损伤和 90% 的冠状动脉疾病病例表现出 VC，显著增加了严重心血管事件的风险 ^1,2。因此，迫切需要找到有效缓解或逆转这种情况的药物治疗。

目前，VC 的治疗策略涉及各种药物干预，但没有专门为此目的设计的药物。对于轻度钙化患者，通常会开具他汀类药物来稳定斑块。然而，虽然它们可以通过降低血脂水平来减少冠状动脉狭窄，但它们对钙化的影响是有限的²。

鉴于动脉粥样硬化的复杂性，许多患者表现出血小板活化增强，因此需要使用阿司匹林或氯吡格雷等抗血小板药物来抑制血小板聚集并降低血栓形成的风险。然而，阿司匹林治疗仅对冠状动脉钙化评分高和出血风险低的个体有益³。

此外，对维生素 K 等补充剂的研究表明，维生素 K 有可能预防 VC 进展⁴。在严重的情况下，可以考虑侵入性干预，尽管它们通常不适用于广泛的 VC⁵。对于没有 VC 的个体，管理风险因素（例如血压、血脂水平和生活方式选择）仍然至关重要⁶。

红景天是 Crassulaceae 科的多年生草本植物，传统上用于中药。它的主要生物活性成分红景天苷因其显着的生物活性而受到广泛关注。红景天苷以其抑制细胞凋亡的能力而闻名，表现出强大的抗氧化特性，并具有抗炎特性 ^7,8。这些属性有助于其增强血管功能、延缓血管衰老和保护血管内皮的潜力。作为 VC 的潜在治疗剂，红景天苷具有重要的研究价值。然而，红景天苷改善 VC 的确切机制仍有待充分阐明，需要进一步研究以利用其治疗 VC 的潜力。

为了探索这些机制，本研究利用网络药理学，这是一种结合药理学、生物信息学和计算机科学的创新方法来分析生物系统并阐明药物机制。与传统的单靶点药物研究相比，网络药理学通过分析药物对多个生物靶点和信号通路的影响，提供了一种更全面的方法。作为现代药物开发的关键工具，它构建了药物、靶标和通路网络，以揭示药物作用的潜在机制 ^9,10。尽管红景天苷在探索治疗机制方面得到了广泛应用，但从生物信息学和网络药理学的角度来看，对红景天苷和 VC 之间的相互作用机制的研究有限。

本研究通过广泛的数据库挖掘识别和分析关键靶点，构建了红景天苷对 VC 潜在影响的分子网络图谱。生成蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络，并应用拓扑分析以突出钙化过程中的关键节点。

为了证实计算预测，通过施用维生素 D3 （VD3） 的高脂肪饮食来开发 VC 大鼠模型。该模型复制了人类 VC 的病理特征。通过组织学技术评估血管损伤，评估血脂谱和炎症标志物以研究红景天苷的全身效应，并使用 Western blotting 测量 SAL 抗 VC 相关蛋白的表达，以探索红景天苷对实验诱导的 VC 的影响，本研究旨在为该化合物作为对抗 VC 的治疗策略的潜力提供有价值的见解。

研究方案

该方案得到了长春中医药大学实验动物委员会的批准（批准号2023091）。本研究遵守国际准则，包括欧洲共同体准则和 1986 年的 EEC 指令，确保在整个研究过程中对动物的道德对待。雄性 Wistar 大鼠 （8-10 周，体重 200-220 g） 用于研究。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 潜在红景天苷-VC 靶点的网络药理学预测

注：网络药理学利用计算方法和大规模数据分析来研究生物体内药物分子与生物靶标（如通路、基因和蛋白质）之间的复杂相互作用^11,12。这种方法有助于破译所研究实体的生物学功能和关系。该方法包括数据库利用、化学信息处理、生物活性数据的获取、蛋白质数据的检索、基因表达谱分析、相互作用网络的构建和途径的富集分析¹¹。图 1 显示了红景天苷和血管钙化之间核心靶点的相互作用网络。

1. 构建“成分”目标数据库
   1. 使用“红景天苷”作为成分的关键字来搜索数据库¹³ （参见 补充表 1），例如 HERB、TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction、CTD、PharmMapper、SEA 和 STITCH。
   2. 查看相关文献以确定与红景天苷相关的靶标，物种设置为 Homo sapiens。去除重复项后，使用 UniProt 标准化靶蛋白（参见 补充表 1）并建立全面的红景天苷靶标数据库¹⁴。
2. 构建“疾病”目标数据库
   1. 使用“血管钙化”作为关键字搜索数据库¹⁵ （参见 补充表 1），包括 GeneCards、OMIM、PharmGkb 和 DrugBank，物种设置为 Homo sapiens。删除重复数据后，创建一个血管钙化目标数据库。
3. 预测潜在的治疗靶点
   1. 输入红景天苷和血管钙化的目标（见 补充表 1）以确定共同目标。生成维恩图以可视化红景天苷治疗血管钙化的潜在治疗靶点。
4. 构建“红景天苷-血管钙化”蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络
   1. 将潜在靶标编译成多种蛋白质列表并使用 STRING 对其进行分析（参见 补充表 1），将生物体设置为 Homo sapiens ，将相互作用分数设置为中等置信度 （>0.4）¹⁶。以 TSV 格式提取 PPI 数据以供进一步分析。
      注意：鉴于 85% 的大鼠基因与人类基因同源，具有相似的生物学功能，因此选择大鼠作为实验对象来验证红景天苷对血管钙化的影响¹⁷。
5. 重点靶点的选择和网络构建
   1. 将 PPI 网络数据导入 Cytoscape 3.9.1（参见 补充表 1）进行分析，使用 CytoNCA 插件评估中介性 （BC）、接近性 （CC）、度数 （DC）、特征向量 （EC）、局部平均连接性 （LAC） 和网络中心性 （NC）。选择 CC=1 的关键靶标，构建 'SAL-VC' 的核心靶标作用谱图。
   2. 使用 CytoHubba 插件根据最大团中心性 （MCC）、最大邻域分量 （MNC） 和度数计算识别前 10 个枢纽基因，生成 Hub 基因光谱图。
6. GO 和 KEGG 通路富集分析
   1. 使用 DAVID 进行基因 ID 转换（参见 补充表 1），为基因类型 9606 选择 ENSEMBL_GENE_ID 以获取物种信息。使用 Omicshare 分析转换后的基因列表（参见 补充表 1）用于 GO 功能和 KEGG 通路富集，显着性设置为 P 值< 0.05¹⁸。
      注：GO 功能分析包括分子功能 （MF）、生物过程 （BP） 和细胞成分 （CC）。KEGG 通路分析涉及通路富集和通路分类富集¹⁹。富集分析结果如图 2 所示。

2. 动物实验

1. 驯化
   1. 使 Wistar 大鼠在无特定病原体 （SPF） 条件下适应 12 小时的光照/黑暗循环。在实验开始前，确保他们可以 随意 获得食物和水以保持健康。进行适应性喂养 1 周。
2. 模型建立
   1. 使大鼠适应环境条件，随机分为五组：对照组（Ctrl、ND + 载体）、模型组（模型、HFD + 载体）、SAL 低剂量组（SAL-L、HFD + SAL 5mg/kg）、SAL 高剂量组（SAL-H、HFD + SAL 10mg/kg）和辛伐他汀 （SIM） 组（HFD + SIM 5mg/kg）。
   2. 在整个实验期间，对 Ctrl 组进行正常饮食 （ND），对其余组进行高脂饮食 （HFD）。在 HFD 给药的第一天，向除 Ctrl 组^20,21 外的所有组注射单次皮下剂量 600,000 IU/kg VD3。在接下来的 8 周内每周皮下注射 100,000 IU/kg VD3（图 3）。
   3. 每天监测动物的健康状况和存活率。在第九周开始实验性干预。
   4. 在研究结束时对动物实施安乐死（遵循机构批准的方案）。收集血清样品，静置 30 分钟，然后离心分离血清（根据先前发表的报告^20,21）。解剖血管组织（腹主动脉），并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗以去除血液。
   5. 将一部分组织固定在 4% 多聚甲醛中用于组织学检查，并将另一部分储存在液氮中用于分子分析。
      注意：使用前用温水稀释红景天苷。

3. 使用 HE、VK、EVG 染色评估血管组织损伤

注：将血管组织（腹主动脉）固定在 4% 多聚甲醛中，48 小时后在乙醇中脱水，并包埋在石蜡中。将包埋的石蜡块切成 5 μm 切片，用于苏木精-伊红 （HE）、Elastica van Gieson （EVG） 和 Von Kossa （VK） 染色，并在光学显微镜下观察组织学形态。HE 染色用于评估组织形态的变化。在血管组织中，它突出了血管壁的结构改变，包括平滑肌细胞增殖、细胞排列紊乱和炎症。EVG 染色可视化弹性纤维和胶原纤维，这对于评估血管组织中的弹性纤维损伤或重塑至关重要，并有助于了解钙化对血管弹性的影响。VK 染色可检测钙沉积，这是 VC 的一个关键特征，因此对于评估血管组织中钙化的程度和分布至关重要^22,23。

1. 用于血管组织损伤检测的 HE 染色
   1. 脱蜡和再水化
      1. 将切片在两次二甲苯中脱蜡，每次 8 分钟，然后通过分级乙醇系列（100%、95%、85%、75%）再水化，每步 3 分钟。然后用流动的自来水冲洗 2 分钟。
   2. 苏木精染色
      1. 用苏木精对切片染色 5-10 分钟，然后洗涤以去除多余的污渍，然后用流动的自来水冲洗。
         注：建议 5 分钟的浅色染色，以避免过暗的染色，这会影响细胞质的颜色。
   3. 分化
      1. 在分化溶液中区分切片 30 秒，然后在自来水中冲洗两次，每次 3 分钟。
   4. 曙红复染
      1. 将切片置于伊红染色中 1 分钟。去除多余的污渍后，进行快速脱水。
   5. 脱水、澄清和封片
      1. 为了快速脱水，将切片分别浸入 75%、85%、95% 和 100% 乙醇中 3 秒，然后用 100% 乙醇浸泡 1 分钟。
         注：建议快速脱水，因为伊红在水和乙醇梯度中可能会失去颜色。
2. 用于钙检测的 VK 染色
   1. 脱蜡和再水化
      1. 按照步骤 3.1.1 执行此步骤。
   2. 硝酸银反应
      1. 将切片吸干，用细刷勾勒轮廓，并用 Von Kossa 染色（参见 材料表）。将它们暴露在紫外线下 4 小时，然后用流动的自来水彻底冲洗。
   3. 苏木精复染
      1. 用苏木精对切片染色 5 分钟，用流动的自来水冲洗，区分，然后再次冲洗，然后用流动的自来水冲洗。
   4. 曙红复染
      1. 通过分级乙醇（85% 和 95% 各 5 分钟）对切片脱水，然后用伊红染色 5 分钟。
   5. 脱水和封片
      1. 在乙醇浴（100% 乙醇 I、II、III 各 5 分钟）中脱水切片，并在二甲苯浴中澄清（二甲苯 I 和 II 各 5 分钟）。然后，用中性香脂安装切片。
   6. 显微镜检查和图像捕捉
      1. 在光学显微镜下检查染色切片并捕获图像进行分析。
         注：确保钙沉积物呈棕黑色至深黑色，细胞核为蓝色，背景为红色。使用前立即准备用于新鲜 VK 染色的硝酸银溶液。
3. 弹性纤维和胶原纤维的 EVG 染色
   1. 脱蜡和再水化
      1. 将石蜡切片加热 50 分钟，然后将它们浸入二甲苯中 20 分钟以去除石蜡。继续将切片置于分级乙醇系列（100%、95%、85%、75%）中各 5 分钟，最后在流动的自来水中冲洗 5 分钟。
   2. EVG 染色
      1. 应用 EVG 染色溶液（参见 材料表）10 分钟，然后在流动的自来水中短暂冲洗 5 秒以去除多余的污渍。
      2. 接下来，应用 Verhoeff 工作溶液（参见 材料表）5 分钟，然后在流动的自来水中再次短暂冲洗 5 秒。应用 Verhoeff 的差异化溶液 5 秒，直到弹性蛋白纤维清晰可见，然后用流动的自来水冲洗 5 秒。
         注：以 5：2：2 的比例混合组分 A、B 和 C（在市售试剂盒中提供），以便在使用前制备 Verhoeff 工作溶液。在 2 小时内使用溶液，并在染色过程中根据需要补充，以防止切片变干。
   3. 脱水和封片
      1. 通过分级乙醇系列（75%、85%、95% 和 100%）对切片脱水，每个 5 秒，然后用两次二甲苯更换澄清，每次 1 分钟。短暂风干后，用中性香脂安装切片。
   4. 显微镜检查和图像分析
      1. 在光学显微镜下检查染色切片，以观察弹性纤维和胶原纤维，并捕获图像以供后续分析。

4. 碱性磷酸酶 （ALP） 测定

注意：使用 ALP 作为评估抗钙化治疗效果的关键指标。

1. 试剂制备
   1. 将显色底物溶解在冰冷的 0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液中，至最终体积为 2.5 mL。
      注：将 1.59 g 碳酸钠和 2.93 g 碳酸氢钠溶于 1,000 mL 双蒸水中，制备缓冲液。
2. 底物稀释
   1. 用 0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释 10 μL 对硝基苯酚溶液 （10 mM），至最终体积为 0.2 mL，最终浓度为 0.5 mM。
3. 样品制备
   1. 在裂解缓冲液中匀浆腹主动脉。离心匀浆（~12,000 x g 在 4 °C 下 10 分钟）并收集上清液用于 ALP 活性检测。
      注：确保裂解缓冲液不含磷酸酶抑制剂。将待处理的测试样品储存在 -80 °C 下，避免重复冻融循环。
4. 用于检测的微孔板制备
   1. 准备一个包含空白孔、标准孔和样品孔的 96 孔板。向标准孔中加入 50 μL 标准溶液，向样品孔中加入 50 μL 待处理的测试样品。将板在 37 °C 下孵育 10 分钟。
5. 反应终止和吸光度测量
   1. 向每个孔中加入 100 μL 终止液以终止反应。测量 405 nm 处的吸光度并根据吸光度值计算 ALP 活性（按照制造商的说明，参见 材料表）。
      注：含有标准品的孔或具有 ALP 活性的样品将显示不同深浅的黄色。颜色可稳定长达 2 小时。

5. 钙含量测定

注：钙含量测定对于评估生物组织中矿化程度至关重要。

1. 组织制备
   1. 将组织切碎成小块，并在裂解缓冲液中匀浆。
2. 样品稀释和离心
   1. 在裂解缓冲液中以 1：10 的比例稀释组织。匀浆混合物并在 4 °C、12,000 x g 下离心 5 分钟。收集上清液进行分析。
      注：使用 5 mM 钙标准溶液制备钙标准品稀释液 （0-1.0 mM）（参见 材料表）。
3. 板设置和孵育
   1. 向 96 孔板的每个孔中加入 50 μL 标准品或测试样品。加入 150 μL 测定工作溶液，充分混合，并在室温下避光孵育板 10 分钟。测量 575 nm 处的吸光度并构建标准曲线。
4. 钙含量的计算
   1. 使用标准曲线计算钙含量，包括稀释因子、样品体积和钙的原子量。

6. 炎性细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的酶联免疫吸附测定 （ELISA）

注：IL-6、IL-1β 和 TNF-α 是关键的促炎细胞因子，可指示炎症反应的存在和严重程度。测量这些细胞因子对于了解炎症过程和评估抗炎治疗的有效性至关重要。

1. 样本采集
   1. 从大鼠的腹主动脉收集血清。让它在室温下凝固 2 小时。将样品在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 10 分钟并收集上清液。
2. 用于测定的微孔板制备
   1. 准备一个 96 孔板，其中有专用于标准品和测试样品的孔。将 50 μL 不同浓度的标准品（参见 材料表）添加到适当的孔中。
3. 样品制备
   1. 向指定用于测试样品的每个孔中加入 40 μL 样品稀释剂。将 10 μL 样品添加到相同的孔中，得到 5 倍稀释。
4. 与酶标记试剂孵育
   1. 向除空白孔外的所有孔中加入 100 μL 对 IL-6、TNF-α 或 IL-1β 具有特异性的酶标记试剂。将板在 37 °C 下孵育 60 分钟。
5. 洗涤
   1. 丢弃除空白孔外的所有孔中的液体。用 1x 洗涤液（在蒸馏水中制备为 20 倍稀释液）洗涤孔。重复此洗涤步骤五次并干燥孔。
6. 显色和终止
   1. 向每个孔中加入 50 μL 底物溶液 A 和 B（来自市售试剂盒，参见 材料表）。轻轻混合，并将板在 37 °C 下避光孵育 15 分钟。向每个孔中加入 50 μL 终止液以终止反应。
7. 吸光度测量和数据分析
   1. 将空白井设置为零。使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。根据 OD 值和标准浓度生成标准曲线。使用插值计算样品浓度并调整稀释因子。

7. 血脂分析

注：血脂谱测定可检测异常的脂质水平，其中脂质水平升高或不平衡会加速血管钙化的风险。

1. 总胆固醇和甘油三酯（TC 和 TG）
   1. 收集血清并制备带有指定孔的 96 孔板，用于空白、校准和待处理的测试样品。向每个孔中加入 2.5 μL 血清、校准标准品或空白溶液。
   2. 向每个孔中加入 250 μL 工作溶液。轻轻混合并将板在 37 °C 下孵育 10 分钟。使用酶标仪测量 500 nm 处的吸光度。
2. 低密度脂蛋白和高密度脂蛋白（LDL-C 和 HDL-C）
   1. 收集血清并制备一个 96 孔板，其中的孔专用于空白、校准和待定测试样品。向相应的孔中加入 2.5 μL 血清、校准标准品或空白溶液。
   2. 按照检测试剂盒说明中的规定，向每个孔中加入适当的试剂（试剂 1 用于 180 μL 或试剂 2 用于 60 μL，参见 材料表）。在每种试剂的建议温度 （37 °C） 和时间（试剂 1 5 分钟或试剂 2 10 分钟）下孵育。
   3. 使用酶标仪测量 LDL-C 或 HDL-C 指示的特定波长 （600 nm） 处的吸光度。

8. 蛋白质印迹

注：Western blot （WB） 有助于评估关键蛋白的表达水平，从而可以检测总蛋白和磷酸化形式。

1. 组织制备
   1. 称取 0.05 g 组织并用 PBS 彻底冲洗以去除多余的碎屑。加入 500 μL 含有 1x 磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。将组织在 4 °C 下孵育 10 分钟，并使用组织研磨机将其匀浆。
2. 蛋白质提取
   1. 让匀浆样品静置 1 分钟，然后在 4 °C 和 12,000 x g 下离心 15 分钟。收集上清液用于蛋白质分析。按照制造商的说明使用 BCA 方法测定蛋白质浓度（参见 材料表）。使用标准曲线计算浓度。
      注：使用前将离心机预冷至 4 °C。测量 562 nm 处的蛋白质浓度。
3. 样品制备
   1. 将蛋白质样品与含有 β-巯基乙醇和 SDS 的 5x 上样缓冲液以 4：1 的比例混合。将混合物在 100 °C 下加热 5 分钟以使蛋白质变性。
      注：如果需要 1x 上样缓冲液，请用裂解缓冲液稀释 5x 缓冲液。
4. SDS-PAGE 凝胶制备
   1. 制备 12% SDS-PAGE 凝胶并将其放入电泳仪中。按照说明添加 1x 电泳缓冲液至中间标记（参见 补充表 2）。
5. 电泳
   1. 从 -20 °C 中检索蛋白质样品。 每孔加载 60 μg 蛋白质并运行凝胶。
   2. 将浓缩凝胶的电流设置为 50 mA 20 分钟，然后增加至 100 mA 分离凝胶 60 分钟，直到染料前沿到达底部。
6. 膜转移
   1. 在甲醇中活化 PVDF 膜 5 分钟。
   2. 按以下顺序组装转移三明治：滤纸→ SDS-PAGE 凝胶→ PVDF 膜→滤纸。以 300 mA 转移蛋白质 60 分钟。
      注：确保 SDS-PAGE 凝胶和 PVDF 膜之间没有气泡。
7. 阻塞
   1. 在室温下将 PVDF 膜在 5% BSA（在 1x TBST 中制备）中孵育，轻轻摇动 60 分钟。用 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
8. 一抗孵育
   1. 将膜在 5 mL 适当的一抗（例如，p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα）中在室温下稀释 2.5 小时。
9. 二抗孵育
   1. 一抗孵育后，用 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。在室温下与适当的二抗孵育 1 小时。用 1x TBST 再次洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
10. 检波
    1. 使用 ECL 化学发光检测²⁴ 可视化蛋白质条带（参见 材料表）。
11. 光密度测定分析
    1. 使用 ImageJ 软件定量蛋白质条带。在 ImageJ 中遵循此工作流程： 图像→ 8 位→处理 → 减去背景。Analyze → Set Measurements → Analyze → Set Scale。编辑 → 反转 → 分析 → 测量 → 结果。文件 → 另存为 → IntDen。
    2. 使用绘图和统计分析软件生成统计图表。
       注：确保结果在重复之间一致，以验证结果。

9. 统计分析

1. 使用 GraphPad Prism 9.0 收集和组织数据。
2. 使用原始数据的平均值 ± SD 计算和绘制误差线。
3. 使用单因子方差分析执行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验以进行多重比较。
4. 确定 P < 0.05 时的统计显着性， P 值越小表示结果差异越大。

结果

网络药理分析

使用 HERB 、 TCMSP 、 Pubmed 、 SwissTargetPrediction 、 CTD 、 PharmMapper 、 SEA 和 STITCH 等数据库，确定了红景天苷的 388 个潜在靶基因。此外，从 GeneCards 、 OMIM 、 PharmGkb 和 DrugBank 等数据库中检索到 2871 个与 VC 相关的潜在靶基因。通过 VENN 图 进行的 交叉分析揭示了 208 个重叠的目标，被认为是红景天苷干预 VC 的关键目标（

讨论

VC 的特征是血管细胞和组织的退行性变化，血管内的病理矿物质沉积导致血管壁变硬或形成动脉粥样硬化斑块，这可能导致阻塞性血管疾病²⁵。研究表明，大约 85% 的 VC 斑块可能会演变成血栓形成，从而引发急性心血管发作。此外，VC 是潜在急性心血管事件、中风和外周血管疾病的关键指标²⁶。目前的治疗方法主要集中在抗凝、降脂药?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% (29:1) Acrylamide/Bis Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	A1010
4% Paraformaldehyde Fix Solution	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0099
5*loading buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	P1040
Alkaline Phosphatase Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0321S
AlphaView Software	Proteinsimple Inc.USA	AlphaView SA
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0012
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1866
Calcium Colorimetric Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	S1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1597
Dewatering machine	Diapath Biosciences  Ltd, Italy	Donatello
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd,China	JB-P5
Enzyme-labeled instrument	Biotek Co., Ltd,USA	Epoch
Ethanol absolute	GHTECH  Co., Ltd, China	64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP	Bioworld technology, co, Ltd.,China	BS20242-Y
GraphPad Prism Software	GraphPad Software.,USA	GraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,China	G1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	A0208
Image J Software	National Institutes of Health(NIH),USA	Image J
IκB Alpha Polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10268-1-AP
JAK2 Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A113
NF-κB p65 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10745-1-AP
Pathological microtome	Leica Biosystems,USA	RM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail Tables	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF2006
Phospho-STAT3(S727) Antibody	Abways  Science & Technology Co., Ltd ,China	CY5291
Protease Inhibitor Cocktail	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	11873580001
PVDF membrane	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	3010040001
Rat IL-1β ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI303
Rat IL-6 ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PI328
Rat TNF-α ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	PT516
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	P0013B
Salisoroside	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,China	S25475
SDS	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China	3250KG001
Sodium carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	1001921933
Sodium hydrogen carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	10018960
Sodium thiosulfate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China	20042518
STAT3 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10253-2-AP
TBST (10×)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , China	ST673
Total cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A111
Triglyceride assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A110
Tris Base	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	1115GR500
Upright optical microscope	Nikon Corporation,Japan	Eclipse E100
Von Kossa Solution	Wuhan servicebio technology CO.,LTD,China	G1043
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc. ,USA	SC-2048
β-Actin antibody	Cell Signaling Technology, Inc.,USA	E4967