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Résumé

Cette étude établit un modèle de rat de calcification vasculaire induite par un régime riche en graisses (HFD) combiné à de la vitamine D3 (VD3). Le modèle a été utilisé pour évaluer l’efficacité thérapeutique du salidroside dans la prévention et le traitement de la calcification vasculaire, fournissant des informations sur ses mécanismes d’action potentiels par le biais de la pharmacologie en réseau et d’expériences in vivo .

Résumé

La calcification vasculaire (CV) est une affection pathologique critique associée à une morbidité et une mortalité importantes. Cette étude utilise une approche hybride de pharmacologie de réseau et de biologie moléculaire pour délimiter les mécanismes thérapeutiques du salidroside (SAL), un composé actif de Rhodiola crenulata, contre la VC. Grâce à l’exploration de bases de données et à l’analyse du réseau, 388 cibles SAL se recoupant avec 2871 cibles associées à VC ont été identifiées, ce qui a donné lieu à 208 cibles communes. Un réseau d’interactions protéine-protéine (IPP) construit à l’aide de la base de données String et de l’analyse topologique dans Cytoscape 3.9.1 a permis d’identifier 10 cibles clés, dont IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 et STAT3, entre autres. Les gènes identifiés étaient concentrés dans les voies des lipides et de l’athérosclérose, indiquant que l’amélioration de la VC par le SAL peut se produire par la régulation de l’expression anormale des facteurs lipidiques et inflammatoires. Il a également été constaté que SAL inhibe l’expression anormale des facteurs inflammatoires, activant ainsi la voie JAK2/STAT3 pour intervenir dans la progression de la VC. La voie JAK2/STAT3 est un mécanisme moléculaire clé par lequel SAL empêche une détérioration supplémentaire des VC. Des analyses d’enrichissement fonctionnel ont révélé l’implication de ces cibles dans les réponses inflammatoires et le métabolisme des lipides, voies pivots dans les VC. Des études in vivo chez le rat ont démontré l’efficacité du SAL dans l’atténuation de la dyslipidémie et de l’inflammation vasculaire, avec de meilleurs profils lipidiques sériques et une réduction des dépôts de calcium vasculaire. L’exploration mécaniste, fondée sur l’analyse par transfert Western, a démontré la capacité du salidroside à réguler la voie de signalisation JAK2/STAT3, mettant en évidence son potentiel en tant que modulateur de ce mécanisme moléculaire critique et offrant une cible thérapeutique potentielle pour la VC. La force de cette recherche réside dans sa rigueur méthodologique, intégrant des prédictions computationnelles à des validations in vivo . Cette approche globale établit un cadre solide pour l’exploration des mécanismes thérapeutiques des composés naturels dans la lutte contre la VC.

Introduction

La calcification vasculaire (VC) fait référence au dépôt anormal de calcium dans les parois des vaisseaux, ce qui entraîne un raidissement artériel et une diminution de l’élasticité, altérant finalement la fonction vasculaire. Traditionnellement, la VC a été divisée en deux types : la calcification intimale, liée à l’accumulation de lipides, et la calcification médiale. Le premier est étroitement associé à l’infiltration inflammatoire, déclenchant une transformation ostéogénique de la paroi vasculaire, caractérisée par la migration, la prolifération et la différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMV) en cellules de type ostéoblaste1.

La capacité des VSMC à subir une différenciation ostéogénique, influencée par des facteurs tels que le vieillissement, la génétique et des conditions environnementales telles que le diabète et les maladies rénales chroniques, est un contributeur majeur à la VC liée à l’âge. Cette transformation ostéoblastique exacerbe la calcification et la dégénérescence artérielles1.

La VC est une maladie à multiples facettes, entraînée par des changements dégénératifs, des déséquilibres métaboliques et diverses conditions systémiques. Environ 80 % des lésions vasculaires et 90 % des cas de maladies coronariennes présentent une CV, ce qui augmente considérablement le risque d’événements cardiovasculaires graves 1,2. Par conséquent, il est urgent de découvrir des traitements pharmacologiques qui atténuent ou inversent efficacement cette condition.

À l’heure actuelle, les stratégies de traitement de la VC impliquent diverses interventions pharmacologiques, bien qu’aucun médicament ne soit spécifiquement conçu à cette fin. Pour les patients présentant une calcification légère, les statines sont souvent prescrites pour stabiliser les plaques. Cependant, bien qu’ils puissent réduire la sténose de l’artère coronaire en abaissant les taux de lipides, leur effet sur la calcification est limité2.

Compte tenu de la complexité de l’athérosclérose, de nombreux patients présentent une activation plaquettaire accrue, nécessitant l’utilisation de médicaments antiplaquettaires comme l’aspirine ou le clopidogrel pour inhiber l’agrégation plaquettaire et réduire le risque de thrombose. Cependant, le traitement à l’aspirine n’est bénéfique que pour les personnes ayant un score calcique élevé dans les artères coronaires et un faible risque de saignement3.

De plus, la recherche sur les suppléments, tels que la vitamine K, suggère un potentiel dans la prévention de la progression de la VC4. Dans les cas graves, des interventions invasives peuvent être envisagées, bien qu’elles soient souvent inadaptées à la VC5 généralisée. Pour les personnes qui n’ont pas de VC existante, la gestion des facteurs de risque, tels que la pression artérielle, les profils lipidiques et les choix de mode de vie, reste essentielle6.

Rhodiola crenulata, une plante herbacée vivace de la famille des Crassulaceae, est traditionnellement utilisée en médecine chinoise. Son principal constituant bioactif, le salidroside, suscite beaucoup d’attention en raison de ses activités biologiques notables. Le salidroside est réputé pour sa capacité à inhiber l’apoptose, présente des propriétés antioxydantes robustes et possède des caractéristiques anti-inflammatoires 7,8. Ces attributs contribuent à son potentiel à améliorer la fonction vasculaire, à retarder le vieillissement vasculaire et à protéger l’endothélium vasculaire. En tant qu’agent thérapeutique potentiel pour la VC, le salidroside a une valeur substantielle pour la recherche. Cependant, les mécanismes précis par lesquels le salidroside améliore la VC restent à élucider et justifient des recherches plus approfondies pour exploiter son potentiel thérapeutique dans le traitement de la VC.

Pour explorer ces mécanismes, cette étude s’appuie sur la pharmacologie en réseau, une méthodologie innovante qui combine la pharmacologie, la bio-informatique et l’informatique pour analyser les systèmes biologiques et élucider les mécanismes médicamenteux. Par rapport à la recherche traditionnelle sur les médicaments à cible unique, la pharmacologie en réseau offre une approche plus complète en analysant les effets d’un médicament sur plusieurs cibles biologiques et voies de signalisation. En tant qu’outil clé dans le développement de médicaments modernes, il construit des réseaux de médicaments, de cibles et de voies pour révéler les mécanismes sous-jacents de l’action des médicaments 9,10. Malgré son utilisation intensive dans l’exploration des mécanismes thérapeutiques, il y a eu peu de recherches sur les mécanismes interactifs entre le salidroside et le VC du point de vue de la bio-informatique et de la pharmacologie en réseau.

Cette recherche construit une carte de réseau moléculaire de l’impact potentiel du salidroside sur le capital-risque en identifiant et en analysant des cibles clés grâce à une exploration approfondie de bases de données. Un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) est généré et une analyse topologique est appliquée pour mettre en évidence les nœuds critiques dans le processus de calcification.

Pour confirmer les prédictions informatiques, un modèle de VC chez le rat est développé en administrant un régime riche en graisses avec de la vitamine D3 (VD3). Ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques de la VC humaine. Les lésions vasculaires sont évaluées à l’aide de techniques histologiques, les profils lipidiques sériques et les marqueurs d’inflammation sont évalués pour étudier les effets systémiques du salidroside, et l’expression des protéines anti-VC SAL est mesurée à l’aide du Western blot pour explorer l’impact du salidroside sur le VC induit expérimentalement, cette étude vise à fournir des informations précieuses sur le potentiel de ce composé en tant que stratégie thérapeutique pour lutter contre le VC.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité des animaux d’expérimentation de l’Université de médecine chinoise de Changchun (approbation n° 2023091). Cette étude respecte les directives internationales, y compris les lignes directrices de la Communauté européenne et la directive CEE de 1986, garantissant le traitement éthique des animaux tout au long de l’étude. Des rats Wistar mâles (8 à 10 semaines, poids de 200 à 220 g) ont été utilisés pour l’étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Prédiction pharmacologique en réseau de cibles potentielles de salidroside-VC

REMARQUE : La pharmacologie en réseau utilise des méthodes informatiques et l’analyse de données à grande échelle pour étudier les interactions complexes entre les molécules médicamenteuses et les cibles biologiques telles que les voies, les gènes et les protéines au sein d’un organisme11,12. Cette approche permet de déchiffrer les fonctions biologiques et les relations des entités étudiées. La méthodologie englobe l’utilisation de bases de données, le traitement de l’information chimique, l’acquisition de données sur la bioactivité, la récupération de données sur les protéines, l’analyse des profils d’expression génique, la construction de réseaux d’interaction et l’analyse de l’enrichissement des voies11. La figure 1 montre le réseau d’interaction des cibles centrales entre le salidroside et la calcification vasculaire.

  1. Construction de la base de données cible « Ingrédients »
    1. Utilisez « Salidroside » comme mot-clé pour les ingrédients afin d’effectuer des recherches dans les bases de données13 (voir le tableau supplémentaire 1), telles que HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA et STITCH.
    2. Examiner la littérature pertinente pour identifier les cibles associées au salidroside, l’espèce étant définie comme Homo sapiens. Après avoir éliminé les doublons, normaliser les protéines cibles à l’aide d’UniProt (voir le tableau supplémentaire 1) et établir une base de données complète de cibles de salidrosides14.
  2. Construction de la base de données cibles « Maladie »
    1. Utilisez « calcification vasculaire » comme mot-clé pour effectuer une recherche dans les bases de données15 (voir le tableau supplémentaire 1), y compris GeneCards, OMIM, PharmGkb et DrugBank, avec l’espèce définie sur Homo sapiens. Après la déduplication, créez une base de données cible de calcification vasculaire.
  3. Prédiction de cibles thérapeutiques potentielles
    1. Entrez les cibles pour le salidroside et la calcification vasculaire (voir le tableau supplémentaire 1) pour identifier les cibles courantes. Générez un diagramme de Venn pour visualiser les cibles thérapeutiques potentielles du salidroside dans le traitement de la calcification vasculaire.
  4. Construction du réseau d’Interaction Protéine-Protéine (IPP) « Calcification Salidroside-Vasculaire »
    1. Compilez les cibles potentielles dans une liste de protéines multiples et analysez-les à l’aide de STRING (voir le tableau supplémentaire 1), avec l’organisme défini à Homo sapiens et le score d’interaction à un niveau de confiance moyen (>0,4)16. Extrayez les données de l’IPP au format TSV pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE : Étant donné que 85 % des gènes du rat sont homologues à des gènes humains, remplissant des fonctions biologiques similaires, des rats ont été sélectionnés comme sujets d’expérience pour valider les effets du salidroside sur la calcification vasculaire17.
  5. Sélection et construction du réseau de cibles clés
    1. Importez les données du réseau PPI dans Cytoscape 3.9.1 (voir le tableau supplémentaire 1) pour analyse à l’aide du plug-in CytoNCA afin d’évaluer des paramètres tels que l’intermédiarité (BC), la proximité (CC), le degré (DC), le vecteur propre (EC), la connectivité moyenne locale (LAC) et la centralité du réseau (NC). Sélectionnez les cibles clés avec CC=1 pour construire une carte du spectre d’action de la cible principale pour 'SAL-VC'.
    2. Utilisez le plug-in CytoHubba pour identifier les 10 principaux gènes pivots sur la base des calculs de centralité de clique maximale (MCC), de composante de voisinage maximale (MNC) et de degré, générant ainsi une carte du spectre des gènes Hub.
  6. Analyse de l’enrichissement des voies GO et KEGG
    1. Effectuer la conversion de l’ID de gène à l’aide de DAVID (voir le tableau supplémentaire 1), en sélectionnant ENSEMBL_GENE_ID pour le type de gène 9606 pour obtenir des informations sur l’espèce. Analyser la liste de gènes convertis à l’aide d’Omicshare (voir le tableau supplémentaire 1) pour l’enrichissement fonctionnel de GO et de la voie KEGG, avec une signification fixée à la valeur P < 0,0518.
      REMARQUE : L’analyse fonctionnelle GO comprend la fonction moléculaire (MF), le processus biologique (BP) et la composante cellulaire (CC). L’analyse des voies KEGG implique l’enrichissement des voies et l’enrichissement de la classification des voies19. Les résultats de l’analyse d’enrichissement sont illustrés à la figure 2.

2. Expérimentation animale

  1. Acclimatation
    1. Acclimatez les rats Wistar dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (SPF) avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. S’assurer qu’ils ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pour rester en bonne santé avant le début des expériences. Effectuez une alimentation adaptative pendant 1 semaine.
  2. Établissement modèle
    1. Acclimatez les rats aux conditions environnementales et répartissez-les au hasard en cinq groupes : groupe témoin (Ctrl, ND + véhicule), groupe modèle (modèle, HFD + véhicule), groupe SAL à faible dose (SAL-L, HFD + SAL 5 mg/kg), groupe SAL à forte dose (SAL-H, HFD + SAL 10 mg/kg) et groupe Simvastatine (SIM) (HFD + SIM 5 mg/kg).
    2. Administrez un régime normal (ND) au groupe Ctrl et un régime riche en graisses (HFD) aux groupes restants pendant toute la durée de l’expérience. Le premier jour de l’administration de HFD, injecter une dose sous-cutanée unique de 600 000 UI/kg de VD3 dans tous les groupes, à l’exception du groupe Ctrl20, 21. Poursuivre avec des injections sous-cutanées hebdomadaires de 100 000 UI/kg de VD3 pendant les 8 semaines suivantes (Figure 3).
    3. Surveiller quotidiennement l’état de santé et la survie des animaux. Commencer les interventions expérimentales au cours de la neuvième semaine.
    4. Euthanasier les animaux à la fin de l’étude (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Prélever des échantillons de sérum, les laisser reposer pendant 30 minutes et les centrifuger pour isoler le sérum (selon les rapports précédemment publiés20,21). Disséquez les tissus vasculaires (aorte abdominale) et rincez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le sang.
    5. Fixer une partie du tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % pour l’examen histologique et stocker une autre partie dans de l’azote liquide pour l’analyse moléculaire.
      REMARQUE : Diluez le salidroside avec de l’eau tiède avant utilisation.

3. Évaluation des lésions du tissu vasculaire à l’aide de la coloration HE, VK, EVG

REMARQUE : Fixez le tissu vasculaire (aorte abdominale) dans du paraformaldéhyde à 4 %, déshydraté dans de l’éthanol après 48 h et incorporé dans de la paraffine. Coupez les blocs de paraffine incrustés en tranches de 5 μm pour la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE), à l’Elastica van Gieson (EVG) et à la coloration Von Kossa (VK), et observez la morphologie histologique au microscope optique. La coloration HE est utilisée pour évaluer les changements dans la morphologie des tissus. Dans le tissu vasculaire, il met en évidence des altérations structurelles de la paroi des vaisseaux, notamment la prolifération des cellules musculaires lisses, l’arrangement cellulaire désorganisé et l’inflammation. La coloration EVG visualise les fibres élastiques et de collagène, ce qui est essentiel pour évaluer les dommages ou le remodelage des fibres élastiques dans les tissus vasculaires et aide à comprendre l’impact de la calcification sur l’élasticité vasculaire. La coloration VK détecte les dépôts de calcium, une caractéristique clé de la VC, ce qui la rend cruciale pour évaluer l’étendue et la distribution de la calcification dans le tissu vasculaire22,23.

  1. Coloration HE pour la détection des lésions du tissu vasculaire
    1. Déparaffinisation et réhydratation
      1. Déparaffiniser les sections en deux changements de xylène pendant 8 minutes chacun et réhydrater à travers une série d’éthanol gradué (100 %, 95 %, 85 %, 75 %) pendant 3 minutes par étape. Poursuivez avec un rinçage de 2 minutes à l’eau courante du robinet.
    2. Coloration à l’hématoxyline
      1. Teignez les sections avec de l’hématoxyline pendant 5 à 10 minutes et lavez pour enlever l’excès de tache, suivi d’un rinçage à l’eau courante du robinet.
        REMARQUE : Une coloration légère de 5 min est recommandée pour éviter une coloration trop foncée, qui peut affecter la couleur cytoplasmique.
    3. Différenciation
      1. Différenciez les sections dans une solution de différenciation pendant 30 s, suivies de deux rinçages à l’eau du robinet pendant 3 min chacun.
    4. Contre-coloration à l’éosine
      1. Placez les sections dans la teinture à l’éosine pendant 1 min. Après avoir enlevé l’excès de tache, effectuez une déshydratation rapide.
    5. Déshydratation, clarification et montage
      1. Pour une déshydratation rapide, trempez les sections dans 75 %, 85 %, 95 % et 100 % d’éthanol pendant 3 s chacune, puis dans 100 % d’éthanol pendant 1 min.
        REMARQUE : Une déshydratation rapide est recommandée car l’éosine peut perdre sa couleur dans l’eau et les gradients d’éthanol.
  2. Coloration VK pour la détection du calcium
    1. Déparaffinisation et réhydratation
      1. Effectuez cette étape en suivant l’étape 3.1.1.
    2. Réaction du nitrate d’argent
      1. Séchez les sections, tracez le contour avec un pinceau fin et teignez avec du Von Kossa (voir le tableau des matériaux). Exposez-les à la lumière ultraviolette pendant 4 h, puis rincez-les abondamment à l’eau courante du robinet.
    3. Contre-coloration à l’hématoxyline
      1. Teignez les sections avec de l’hématoxyline pendant 5 min, rincez à l’eau courante du robinet, différenciez et rincez à nouveau, suivi d’un rinçage à l’eau courante du robinet.
    4. Contre-coloration à l’éosine
      1. Déshydratez les sections à l’éthanol gradué (85 % et 95 % pendant 5 min chacune), puis colorez avec de l’éosine pendant 5 min.
    5. Déshydratation et montage
      1. Déshydrater les sections dans des bains d’éthanol (100 % d’éthanol I, II, III pendant 5 min chacun) et clarifier dans des bains de xylène (xylène I et II pendant 5 min chacun). Ensuite, montez les sections avec du baume neutre.
    6. Examen microscopique et capture d’images
      1. Examinez les sections colorées au microscope optique et capturez des images pour analyse.
        REMARQUE : Assurez-vous que les dépôts de calcium apparaissent brun-noir à noir foncé, que les noyaux sont bleus et que le fond est rouge. Préparez la solution de nitrate d’argent pour une coloration VK fraîche immédiatement avant utilisation.
  3. Coloration EVG pour les fibres élastiques et de collagène
    1. Déparaffinisation et réhydratation
      1. Traitez les sections de paraffine avec de la chaleur pendant 50 min, puis plongez-les dans du xylène pendant 20 min pour éliminer la paraffine. Procédez en soumettant les sections à une série d’éthanol gradué (100 %, 95 %, 85 %, 75 %) pendant 5 minutes chacune, en terminant par un rinçage à l’eau courante du robinet pendant 5 minutes.
    2. Coloration EVG
      1. Appliquez la solution de coloration EVG (voir tableau des matériaux) pendant 10 min, puis rincez brièvement à l’eau courante du robinet pendant 5 s pour éliminer l’excès de tache.
      2. Ensuite, appliquez la solution de travail de Verhoeff (voir tableau des matériaux) pendant 5 min, suivie d’un autre bref rinçage à l’eau courante du robinet pendant 5 s. Appliquez la solution de différenciation de Verhoeff pendant 5 s jusqu’à ce que les fibres d’élastine soient clairement visibles, puis rincez à l’eau courante du robinet pendant 5 s.
        REMARQUE : Mélangez les composants A, B et C (fournis dans le kit disponible dans le commerce) dans un rapport de 5:2:2 pour préparer la solution de travail Verhoeff avant utilisation. Utilisez la solution dans les 2 h et réapprovisionnez-la au besoin pendant le processus de coloration pour éviter que les sections ne se dessèchent.
    3. Déshydratation et montage
      1. Déshydrater les sections à l’aide d’une série graduée d’éthanol (75 %, 85 %, 95 % et 100 %) pendant 5 s chacune, suivie d’une clarification en deux changements de xylène pendant 1 minute chacune. Après une brève période de séchage à l’air, montez les sections avec du baume neutre.
    4. Examen microscopique et analyse d’images
      1. Examinez les sections colorées au microscope optique pour visualiser les fibres élastiques et de collagène, et capturez des images pour une analyse ultérieure.

4. Dosage de la phosphatase alcaline (ALP)

REMARQUE : Utilisez l’ALP comme indicateur clé pour évaluer l’efficacité des traitements anti-calcification.

  1. Préparation des réactifs
    1. Dissoudre le substrat colorant dans un tampon carbonaté glacé de 0,05 M pH 9,6 jusqu’à un volume final de 2,5 mL.
      REMARQUE : Préparez le tampon en dissolvant 1,59 g de carbonate de sodium et 2,93 g de bicarbonate de sodium dans 1 000 ml d’eau bidistillée.
  2. Dilution du substrat
    1. Diluer 10 μL de solution de p-nitrophénol (10 mM) avec un tampon carbonaté à 0,05 M de pH 9,6 jusqu’à un volume final de 0,2 mL pour obtenir une concentration finale de 0,5 mM.
  3. Préparation des échantillons
    1. Homogénéiser l’aorte abdominale dans un tampon de lyse. Centrifuger l’homogénat (~12 000 x g pendant 10 min à 4 °C) et prélever le surnageant pour la détection de l’activité ALP.
      REMARQUE : Assurez-vous que le tampon de lyse est exempt d’inhibiteurs de phosphatase. Conservez les échantillons d’essai en attente à -80 °C, en évitant les cycles répétés de congélation-décongélation.
  4. Préparation de microplaques pour l’essai
    1. Préparez une plaque de 96 puits avec des puits blancs, standard et d’échantillonnage. Ajouter 50 μL de la solution étalon dans les puits étalons et 50 μL d’échantillons d’essai en attente dans les puits d’échantillonnage. Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min.
  5. Terminaison de réaction et mesure de l’absorbance
    1. Ajouter 100 μL de solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction. Mesurez l’absorbance à 405 nm et calculez l’activité ALP en fonction des valeurs d’absorbance (en suivant les instructions du fabricant, voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les puits contenant l’étalon ou les échantillons avec une activité ALP présenteront des nuances variables de jaune. La couleur est stable jusqu’à 2 h.

5. Détermination de la teneur en calcium

REMARQUE : La détermination de la teneur en calcium est essentielle pour évaluer l’étendue de la minéralisation dans les tissus biologiques.

  1. Préparation des tissus
    1. Hachez le tissu en petits morceaux et homogénéisez-le dans un tampon de lyse.
  2. Dilution et centrifugation de l’échantillon
    1. Diluez le tissu dans un tampon de lyse dans un rapport de 1:10. Homogénéiser le mélange et centrifuger à 4 °C, 12 000 x g pendant 5 min. Prélever le surnageant pour analyse.
      REMARQUE : Préparez les dilutions étalons de calcium (0-1,0 mM) en utilisant une solution étalon de calcium 5 mM (voir le tableau des matériaux).
  3. Mise en place et incubation des plaques
    1. Ajouter 50 μL d’échantillons d’étalon ou d’essai dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 150 μL de solution d’analyse, bien mélanger et incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min. Mesurez l’absorbance à 575 nm et construisez une courbe standard.
  4. Calcul de la teneur en calcium
    1. Calculez la teneur en calcium à l’aide de la courbe standard, en incorporant le facteur de dilution, le volume de l’échantillon et le poids atomique du calcium.

6. Dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour les cytokines inflammatoires (IL-6, TNF-α, IL-1β)

REMARQUE : L’IL-6, l’IL-1β et le TNF-α sont des cytokines pro-inflammatoires clés qui indiquent la présence et la gravité d’une réponse inflammatoire. La mesure de ces cytokines est essentielle pour comprendre le processus inflammatoire et évaluer l’efficacité des traitements anti-inflammatoires.

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Prélevez le sérum de l’aorte abdominale du rat. Laisser coaguler à température ambiante pendant 2 h. Centrifuger l’échantillon à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C et prélever le surnageant.
  2. Préparation des microplaques pour le dosage
    1. Préparez une plaque de 96 puits avec des puits désignés pour les étalons et les échantillons d’essai. Ajouter 50 μL d’étalons (voir le tableau des matériaux) à des concentrations variables dans les puits appropriés.
  3. Préparation des échantillons
    1. Ajouter 40 μL de diluant dans chaque puits désigné pour les échantillons d’essai. Ajoutez 10 μL de l’échantillon dans les mêmes puits, ce qui entraîne une dilution de 5 fois.
  4. Incubation avec des réactifs marqués aux enzymes
    1. Ajouter 100 μL de réactifs marqués par des enzymes spécifiques à l’IL-6, au TNF-α ou à l’IL-1β dans tous les puits sauf le blanc. Incuber la plaque à 37 °C pendant 60 min.
  5. Lavage
    1. Jetez le liquide de tous les puits sauf le blanc. Lavez les puits avec 1 solution de lavage (préparée en dilution 20 fois dans de l’eau distillée). Répétez cette étape de lavage cinq fois et séchez les puits.
  6. Développement et terminaison des couleurs
    1. Ajouter 50 μL de solutions de substrat A et B (provenant du kit disponible dans le commerce, voir la table des matériaux) dans chaque puits. Mélangez délicatement et laissez incuber la plaque à 37 °C dans l’obscurité pendant 15 min. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction.
  7. Mesure de l’absorbance et analyse des données
    1. Réglez le puits de vide sur zéro. Mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Générez une courbe standard basée sur les valeurs de DO et les concentrations standard. Calculer les concentrations de l’échantillon à l’aide de l’interpolation et ajuster le facteur de dilution.

7. Dosage du profil lipidique

REMARQUE : Le test du profil lipidique détecte des taux de lipides anormaux, où des taux de lipides élevés ou déséquilibrés peuvent accélérer le risque de calcification vasculaire.

  1. Cholestérol total et triglycérides (CT et TG)
    1. Prélevez le sérum et préparez une plaque de 96 puits avec des puits désignés pour les échantillons à blanc, d’étalonnage et en attente. Ajoutez 2,5 μL de sérum, d’étalon ou de solution à blanc dans chaque puits.
    2. Ajouter 250 μL de la solution de travail dans chaque puits. Mélangez délicatement et laissez incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min. Mesurez l’absorbance à 500 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  2. Lipoprotéines de basse densité et lipoprotéines de haute densité (LDL-C et HDL-C)
    1. Prélevez le sérum et préparez une plaque de 96 puits avec des puits désignés pour les échantillons à blanc, d’étalonnage et en attente. Ajoutez 2,5 μL de sérum, d’étalon ou de solution à blanc dans les puits respectifs.
    2. Ajoutez le réactif approprié (réactif un pour 180 μL ou réactif deux pour 60 μL, voir la table des matériaux) dans chaque puits comme spécifié dans les instructions du kit de test. Incuber à la température (37 °C) et pendant le temps (réactif un pendant 5 min ou réactif deux pendant 10 min) recommandé pour chaque réactif.
    3. Mesurez l’absorbance à la longueur d’onde spécifique (600 nm) indiquée pour le LDL-C ou le HDL-C à l’aide d’un lecteur de microplaques.

8. Transfert Western

REMARQUE : Le Western blot (WB) joue un rôle déterminant dans l’évaluation des niveaux d’expression des protéines clés, permettant de détecter les formes totales et phosphorylées.

  1. Préparation des tissus
    1. Pesez 0,05 g de mouchoir en papier et rincez abondamment avec du PBS pour éliminer l’excès de débris. Ajouter 500 μL de tampon de lyse contenant 1x inhibiteurs de phosphatase et de protéase. Incuber le tissu à 4 °C pendant 10 min et l’homogénéiser à l’aide d’un broyeur de tissus.
  2. Extraction des protéines
    1. Laisser reposer l’échantillon homogénéisé pendant 1 min, puis le centrifuger à 4 °C et 12 000 x g pendant 15 min. Prélever le surnageant pour l’analyse des protéines. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode des ACF en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Utilisez une courbe standard pour calculer la concentration.
      REMARQUE : Pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C avant utilisation. Mesurer la concentration en protéines à 562 nm.
  3. Préparation des échantillons
    1. Mélangez l’échantillon de protéines avec un tampon de charge 5x contenant du β-mercaptoéthanol et du SDS dans un rapport de 4:1. Chauffer le mélange à 100 °C pendant 5 min pour dénaturer les protéines.
      REMARQUE : Si 1x tampon de chargement est nécessaire, diluez le tampon 5x avec un tampon de lyse.
  4. Préparation du gel SDS-PAGE
    1. Préparez un gel SDS-PAGE à 12 % et placez-le dans l’appareil d’électrophorèse. Ajoutez 1x tampon d’électrophorèse jusqu’à mi-chemin selon les instructions (voir tableau supplémentaire 2).
  5. Électrophorèse
    1. Récupérez les échantillons de protéines à -20 °C. Chargez 60 μg de protéines par puits et faites couler le gel.
    2. Réglez le courant à 50 mA pendant 20 min pour le gel d’empilage, puis augmentez à 100 mA pendant 60 min pour le gel de séparation jusqu’à ce que la façade du colorant atteigne le fond.
  6. Transfert membranaire
    1. Activez la membrane PVDF dans du méthanol pendant 5 min.
    2. Assemblez le sandwich de transfert dans l’ordre suivant : papier filtre → gel SDS-PAGE → membrane PVDF → papier filtre. Transférez les protéines à 300 mA pendant 60 min.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée entre le gel SDS-PAGE et la membrane PVDF.
  7. Bloquant
    1. Incuber la membrane PVDF dans 5 % de BSA (préparé en 1x TBST) à température ambiante en secouant doucement pendant 60 min. Lavez la membrane avec 1x TBST trois fois pendant 5 min chacune.
  8. Incubation primaire de l’anticorps
    1. Incuber la membrane dans 5 mL de l’anticorps primaire approprié (p. ex., p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) dilué dans un tampon de blocage à température ambiante pendant 2,5 h.
  9. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Laver la membrane avec 1x TBST trois fois pendant 5 minutes chacune après l’incubation de l’anticorps primaire. Incuber avec l’anticorps secondaire approprié à température ambiante pendant 1 h. Lavez à nouveau la membrane avec 1x TBST trois fois pendant 5 min chacune.
  10. Détection
    1. Visualisez les bandes de protéines à l’aide de la détection de chimiluminescence ECL24 (voir le tableau des matériaux).
  11. Analyse densitométrique
    1. Quantifiez les bandes de protéines à l’aide du logiciel ImageJ. Suivez ce flux de travail dans ImageJ : Image → 8 bits → Traiter → Soustraire l’arrière-plan. Analysez → définissez des mesures → analysez → échelle définie. Modifiez → inversez → analysez → mesurez → résultats. Fichier → Enregistrer sous → IntDen.
    2. Générer des graphiques statistiques à l’aide de logiciels de graphiques et d’analyse statistique.
      REMARQUE : Assurez-vous que les résultats sont cohérents entre les répétitions pour valider les résultats.

9. Analyse statistique

  1. Collectez et organisez des données à l’aide de GraphPad Prism 9.0.
  2. Calculez et tracez des barres d’erreur à l’aide de la moyenne ± de l’écart-type à partir de données brutes.
  3. Effectuez une analyse statistique à l’aide de l’ANOVA à un facteur, suivie du test post-hoc de Tukey pour les comparaisons multiples.
  4. Déterminez la signification statistique à P < 0,05, les valeurs P plus petites indiquant des différences plus importantes dans les résultats.

Résultats

Analyse pharmacologique en réseau

À l’aide de bases de données telles que HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA et STITCH, 388 gènes cibles potentiels du salidroside ont été identifiés. De plus, 2871 gènes cibles potentiels liés à la VC ont été récupérés à partir de bases de données telles que GeneCards, OMIM, PharmGkb et DrugBank. L’analyse des intersections via les diagrammes de VENN ...

Discussion

La VC se caractérise par des modifications dégénératives des cellules et des tissus vasculaires, avec des dépôts minéraux pathologiques dans les vaisseaux sanguins entraînant un raidissement des parois des vaisseaux ou la formation de plaques d’athérosclérose, ce qui peut entraîner des maladies vasculaires obstructives25. Des études montrent qu’environ 85 % des plaques de VC peuvent évoluer vers une thrombose, ce qui peut déclencher des épisodes...

Déclarations de divulgation

Assurez-vous que tous les auteurs ont divulgué tout conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par le projet du Département provincial de la science et de la technologie du Jilin (YDZJ202301ZYTS460) et le projet du Département provincial de l’éducation du Jilin (JJKH20230991KJ).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
30% (29:1) Acrylamide/Bis SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaA1010
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0099
5*loading bufferBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaP1040
Alkaline Phosphatase Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0321S
AlphaView SoftwareProteinsimple Inc.USAAlphaView SA
BCA Protein Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0012
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1866
Calcium Colorimetric Assay KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaS1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1597
Dewatering machineDiapath Biosciences  Ltd, ItalyDonatello
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., Ltd,ChinaJB-P5
Enzyme-labeled instrument Biotek Co., Ltd,USAEpoch
Ethanol absoluteGHTECH  Co., Ltd, China64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRPBioworld technology, co, Ltd.,ChinaBS20242-Y
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software.,USAGraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain KitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd ,ChinaG1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Guangzhou saiguo biotech Co.,LTDA0208
Image J SoftwareNational Institutes of Health(NIH),USAImage J 
IκB Alpha Polyclonal antibodyProteintech Group, Inc.A,USA10268-1-AP
JAK2 AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA113
NF-κB p65 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10745-1-AP
Pathological microtomeLeica Biosystems,USARM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail TablesF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) AntibodyAffinity Biosciences Co., Ltd,ChinaAF2006
Phospho-STAT3(S727) AntibodyAbways  Science & Technology Co., Ltd ,ChinaCY5291
Protease Inhibitor Cocktail F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland11873580001
PVDF membraneF. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland3010040001
Rat IL-1β ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPI328
Rat TNF-α ELISA KitBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaPT516
RIPA Lysis BufferBeyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaP0013B
SalisorosideShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,ChinaS25475
SDSGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China3250KG001
Sodium carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China1001921933
Sodium hydrogen carbonateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China10018960
Sodium thiosulfateChina National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , China20042518
STAT3 AntibodyProteintech Group, Inc.A,USA10253-2-AP
TBST (10×)Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , ChinaST673
Total cholesterol assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA111
Triglyceride assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,ChinaA110
Tris BaseGuangzhou saiguo biotech Co.,LTD1115GR500
Upright optical microscopeNikon Corporation,JapanEclipse E100
Von Kossa Solution Wuhan servicebio technology CO.,LTD,ChinaG1043
Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz Biotechnology, Inc. ,USASC-2048
β-Actin antibody Cell Signaling Technology, Inc.,USAE4967

Références

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