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Method Article
Este protocolo detalla el ensamblaje de matrices de mini-biorreactores que se utilizarán para el cultivo de flujo continuo de comunidades fecales complejas en condiciones anaeróbicas. También discutimos los métodos de ensamblaje, inoculación y muestreo de los reactores para su posterior análisis.
La microbiota, especialmente las bacterias, responde a diversas exposiciones ambientales, como micro y macronutrientes, compuestos farmacológicos y mediadores inflamatorios, que alteran dinámicamente la composición de la comunidad y la producción metabólica microbiana. La comprensión de cómo las condiciones fisiológicas del cultivo afectan a las comunidades y diversidad microbianas y a su capacidad metabólica aportará importantes conocimientos sobre su impacto en la salud y las enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo adaptado de la plantilla publicada por Auchtung et al. para crear matrices de mini-biorreactores que pueden cultivar comunidades fecales complejas, definir consorcios bacterianos o cepas individuales en condiciones precisas, incluida la disponibilidad de nutrientes, la temperatura, el caudal, el pH y el contenido de oxígeno. Describimos el proceso de construcción del sistema de mini-biorreactor, incluyendo adaptaciones para mejorar las limitaciones en el protocolo publicado. También discutimos la configuración del sistema de mini-biorreactor en condiciones anaeróbicas con el uso de medios MEGA (adaptado de Han et al.), que es un medio rico que apoya el crecimiento de diversas bacterias. Describimos la inoculación de muestras fecales de ratón humanizadas intestinalmente en el sistema de mini-biorreactor, seguida del establecimiento de cultivos comunitarios complejos dentro del sistema de mini-biorreactor, que pueden cultivarse bajo flujo continuo con muestreo aséptico para monitorear la composición de la comunidad. Este sistema es adaptable a los cambios dietéticos y otras modificaciones culturales. Las técnicas aquí descritas permiten la caracterización de comunidades fecales diversas y fastidiosas en condiciones dinámicas o en respuesta a perturbaciones aisladas de factores derivados del huésped.
La microbiota intestinal es una vasta red de microorganismos, entre los que se encuentran bacterias, hongos, arqueas y virus, que contienen un enorme repertorio genético y metabólico que supera en gran medida al de un huésped humano1. La rica capacidad metabólica del microbioma incluye metabolitos producidos a partir del procesamiento bacteriano de nutrientes dietéticos, metabolitos del huésped modificados químicamente por bacterias y metabolitos sintetizados únicamente por la microbiota2. La microbiota está implicada en casi todos los bioprocesos del huésped, pero también en estados patológicos como la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer, los trastornos metabólicos e incluso los trastornos neurológicos 2,3. Diseccionar la contribución de la microbiota a la del huésped es esencial para comprender el papel de microorganismos específicos o comunidades complejas en la salud y la enfermedad. Un enfoque que permite esta disección es el uso de biorreactores microbianos, que cultivan diversas comunidades microbianas en condiciones dinámicas. Hay muchos biorreactores disponibles comercialmente que permiten el crecimiento de comunidades bacterianas fecales para casi cualquier propósito, incluido el cultivo de bioproductos a gran escala o el control preciso de factores nutritivos específicos para el estudio de los procesos metabólicos. Sin embargo, estos sistemas son enormemente costosos y requieren una preparación extensa, y no permiten examinar diversas condiciones experimentales en paralelo. Para un enfoque simplificado que sea menos costoso, más adaptable y permita muchas condiciones paralelas, presentamos aquí el protocolo para la configuración y el uso de un conjunto de mini-biorreactores bajo flujo continuo adaptado de Auchtung et al.4.
La configuración completa del sistema de mini-biorreactor se muestra en la Figura 1A. Este sistema de mini-biorreactor utiliza matrices de 6 pozos de reactor, que son completamente independientes entre sí y están configurados en una cámara anaeróbica bajo flujo peristáltico para permitir la entrega y eliminación continua de medios (Figura 1A). Cada conjunto de reactores se asienta sobre una placa de agitación magnética de 60 posiciones, con dos bombas peristálticas de 48 casetes que sostienen tubos de 2 paradas para el medio fuente y el flujo de desechos (Figura 1A). La cámara anaeróbica está equipada con un monitor anaeróbico CAM-12 para el contenido de oxígeno, una caja de catalizadores para eliminar oxígeno con capacidad de calentamiento y una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno para absorber el exceso de gas del metabolismo bacteriano. Cada pozo del reactor está equipado con una entrada de medio fuente, una salida de desechos y un puerto de muestreo, lo que permite la inoculación o el muestreo de cada pozo de reactor individual (Figura 1B).
Como se describe, el sistema de biorreactor permite el control dinámico de la temperatura, el consumo de medios y la disponibilidad de nutrientes para apoyar el cultivo y el mantenimiento de las comunidades fecales. La temperatura es modulada por una caja de catalizadores con capacidad calorífica, lo que permite implementar rápidamente cambios de temperatura en toda la cámara anaeróbica. El consumo de medios está regulado por los caudales de la bomba peristáltica, que se pueden modificar para cambiar la rotación de los medios en los reactores. La rotación de medios se puede personalizar para los tipos de comunidad que se cultivan en los reactores, por ejemplo, que se adaptan para cepas objetivo de crecimiento lento o muy rápido. Por último, la disponibilidad de nutrientes se puede modificar dinámicamente mediante la adición de componentes a través de los puertos de muestra individuales para cada pozo del reactor. Las condiciones estáticas que pueden modificarse al comienzo de un experimento, pero que no tienen control dinámico en el sistema, son el tipo de medio, el contenido de oxígeno y el número de reactores simultáneos. Los investigadores pueden optar por implementar cualquier medio de origen que deseen, y mientras se describe un medio aquí, se han implementado con éxito muchos otros tipos de medios de origen. Se pueden operar los reactores en condiciones aeróbicas o microaerófilas (dependiendo de la disponibilidad de una cámara microaerófila). Por último, se pueden instalar tantos o tan pocos reactores como sea necesario en función de las necesidades experimentales del investigador. Si bien los reactores están en grupos de seis dentro de una matriz, cada reactor funciona independientemente de los demás, y cada uno se puede conectar a una fuente diferente si se desea.
Este sistema de biorreactor modular se puede configurar completamente por alrededor de $ 25,000 (sin incluir la cámara anaeróbica o los componentes específicos de la cámara), y la única parte no reutilizable es la tubería que se puede reemplazar por menos de $ 100 por ejecución del sistema. El sistema está automatizado en su mayor parte, pero requiere una verificación diaria de los niveles de medios, ya que las botellas de fuentes de medios deberán cambiarse cuando estén vacías. Además, cualquier muestreo debe completarse manualmente, y cualquier cambio condicional dinámico en el sistema deberá iniciarse manualmente (por ejemplo, cambiar la temperatura). A partir del protocolo del sistema original publicado por Auchtung et al., se implementaron algunas modificaciones para mejorar el rendimiento general y la utilidad4. En primer lugar, el material para la impresión 3D de la matriz de biorreactores se modifica para que sea un plástico transparente translúcido similar al ABS para mejorar la integridad estructural del sistema mediante rondas repetidas de autoclave. Además, en lugar de la tubería de PTFE de 1/8 de pulgada (3,2 mm) de diámetro exterior, E-LFL, 2,06 mm de diámetro interior, se utiliza una tubería de 100 pies debido al material más resistente, que es más resistente al colapso, lo que causaría bloqueos en el flujo en el sistema. Por último, se utiliza un accesorio adicional que utiliza una rosca de 1/4 -28 mm a adaptadores macho de púas para reducir los cambios en el deslizamiento del tubo de las botellas de fuente de medios. De Han et al., la receta adaptada de medios MEGA proporciona un medio indefinido, complejo y altamente rico que permite el cultivo de microorganismos anaeróbicos exigentes5. El medio se modifica para utilizar una preparación alternativa del componente histidina-hematina, ya que el original ya no está disponible comercialmente. El hidróxido de sodio también se utiliza para pH del medio a 7.0 o cualquier pH deseado. En general, este sistema es económico y fácil de usar, optimizado y un excelente punto de entrada a los sistemas de cultivo de flujo continuo.
En este protocolo, describimos en detalle la configuración de este sistema de matriz de mini-biorreactores, incluidos los materiales, la esterilización del sistema y el uso posterior para el cultivo de muestras fecales murinas humanizadas intestinalmente. El objetivo general de este método es construir un sistema de biorreactor adaptable y rentable que pueda utilizarse para cultivar comunidades microbianas en condiciones controladas. En la Figura 2 se proporciona un esquema detallado del flujo de trabajo para el ensamblaje del sistema de mini-biorreactor y se hace referencia a él en los pasos apropiados dentro del protocolo. En nuestro ejemplo, inoculamos dos reactores con la misma muestra fecal de ratones intestinales humanizados y describimos la estructura de la comunidad microbiana bajo un flujo continuo de medios MEGA.
Figura 1: Diagrama esquemático de la configuración del conjunto de mini-biorreactores en la cámara anaeróbica. (A) Vista completa de la configuración completa del conjunto de mini-biorreactores en la cámara anaeróbica. El conjunto de biorreactores de 6 pocillos está situado en la placa de agitación magnética de 60 posiciones. La red de tee luer de origen está conectada al medio de origen en el lado izquierdo a través de la tapa de botella de dos orificios. Dos bombas peristálticas sujetan la tubería de 2 paradas desde la fuente y las redes de residuos a la izquierda y a la derecha, respectivamente. La red de residuos se vacía en la botella de residuos del lado derecho. El equipo esencial para el funcionamiento de la cámara anaeróbica, incluido el monitor CAM-12, la caja de catalizador con capacidad de calentamiento y la columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno, están dispuestos dentro de la cámara alrededor del sistema de matriz. (B) Vista superior de los puertos de fuente, muestra y desechos conectados a un pozo de reactor con medios a la altura adecuada en el reactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático del flujo de trabajo de ensamblaje de matrices de mini-biorreactores. (A) Vista de arriba hacia abajo del conjunto de mini-biorreactores, que muestra la orientación de la fuente, los desechos y los puertos de muestra. (B) Vista lateral del conjunto de mini-biorreactores con una vista que ilustra los pasos 2.3-2.4 del protocolo. El tubo y el accesorio de PTFE de 1/8 de pulgada (1) se conectan e insertan en los puertos de desechos y muestras. El accesorio (1) sin PTFE se inserta en el puerto de origen. (C) Vista lateral del conjunto de mini-biorreactores que ilustra los pasos 2.5-2.6 del protocolo. El accesorio (2) está conectado a los puertos de origen y desechos. El accesorio (3) se conecta al puerto de muestra, y a él, el accesorio (4) se inserta en la parte superior. (D) Vista lateral del conjunto de mini-biorreactores que ilustra los pasos 2.9-2.11. La tubería E-LFL de 2,06 mm está conectada a los puertos de origen y desagüe, y el otro extremo está conectado a los accesorios (5) y luego (6). A continuación, se conecta un tubo de 2 paradas del diámetro adecuado al accesorio (6). A continuación, la conexión inversa se repite en el extremo del tubo de 2 pasos, con el accesorio (6) conectándose al tubo de 2 pasos y el accesorio (5) conectándose a él. Por último, la tubería E-LFL de 2,06 mm se conectará al racor (5) para la conexión a la red de luer tee. (E) Vista arriba hacia abajo del conjunto de mini-biorreactores que muestra la fuente y la configuración de la red de aguas residuales descrita en los pasos 2.12-2.15. La tubería E-LFL de 2,06 mm que termina en el accesorio (5) se utiliza para conectar cada reactor a varios accesorios (7), cuya última abertura está conectada a la tapa de la fuente o botella de desecho. (F) Vista lateral del conjunto de tapas de botellas de dos orificios descrito en los pasos 2.16-2.17. Una abertura en la tapa está conectada a un tubo de PTFE que se coloca dentro de la botella. A esa abertura se inserta el accesorio (1), seguido del accesorio (2) y el tubo E-LFL de 2,06 mm conectado al accesorio (5). Este accesorio se conecta a la red de fuente o de residuos. En la abertura no conectada a la tubería de PTFE, se inserta el accesorio (1), seguido del accesorio (2), y el tubo E-LFL de 2,06 mm se conecta a otro accesorio (5). Este extremo se tapa con papel de aluminio durante la esterilización en autoclave para su futura conexión a un filtro de jeringa estéril de 0,22 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las muestras fecales utilizadas en este estudio se obtuvieron de experimentos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida (UF) y se realizaron en las Instalaciones de Cuidado Animal de la UF (Protocolo #IACUC202300000005 IACUC). En resumen, el tipo salvaje libre de gérmenes de género mixto (GF WT; Los ratones C57BL/6) (criados y mantenidos en aisladores por la División Libre de Gérmenes de UF Animal Care Services) fueron transferidos de los aisladores de cría y colocados en el sistema de bioexclusión ISOcage P para permitir la manipulación microbiana. Unidades formadoras de colonias (UFC) iguales de las heces de donantes humanos se agruparon para la sonda nasogástrica en ratones. Dos semanas después de la inoculación, se recogieron muestras fecales de estos ratones de forma aséptica para su almacenamiento y posterior uso en este protocolo.
NOTA: La recolección y preparación de muestras fecales descritas aquí solo pretenden ser un ejemplo de un procedimiento adecuado, ya que dependiendo del tipo de muestras recolectadas (humano, ratón, otro animal) y el almacenamiento de estas muestras, este procedimiento puede variar ampliamente. Las personas deben consultar la bibliografía apropiada para diseñar un protocolo para la recolección y preservación de muestras fecales basado en las necesidades del investigador individual.
1. Preparación típica de muestras fecales para almacenamiento a -80 °C
2. Construcción de un conjunto de reactores de 6 pozos
3. Preparación de medios MEGA
4. Configuración de la matriz en cámara anaeróbica
NOTA: Es esencial limpiar el interior de la capucha y los guantes de la capucha con peróxido de hidrógeno al 3%, seguido de un triple enjuague con agua desionizada para garantizar que no se contamine la superficie antes del montaje. Si las conexiones se realizan rápidamente después de la extracción de la lámina y no se produce un contacto directo con el interior de los accesorios y los guantes de la cámara anaeróbica, la posibilidad de contaminación es mínima
5. Inoculación de muestras fecales
6. Recogida aséptica de muestras de los pozos de los reactores
7. Deconstrucción y limpieza del sistema de mini-biorreactor
Se recogieron muestras fecales de ratones colonizados con purín fecal humano 2 semanas después de la inoculación y se almacenaron a -80 °C. El sistema de biorreactor se configuró con flujo continuo de medios MEGA para dos pozos de reactores replicados (Figura 3A). La suspensión fecal se preparó a partir de los gránulos fecales de ratón de acuerdo con el protocolo descrito en el paso 6, y ambos reactores se inocularo...
El sistema de mini-biorreactor descrito en este protocolo permite el cultivo de comunidades fecales independientes para la experimentación paralela. Esta capacidad de estudiar las comunidades microbianas de forma aislada de los factores del huésped es un enfoque esencial para comprender la capacidad intrínseca de los microorganismos para adaptarse a su entorno. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para el cultivo de consorcios bacterianos definidos o incluso cultivos aislados i...
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Los autores están agradecidos a Josee Gauthier por la ayuda con la secuenciación del gen 16S rRNA. Esta investigación fue apoyada, en parte, por los Fondos del Centro Oncológico de UF Health (C.J.) y el Fondo Gatorade del Departamento de Medicina de la UF (C.J.). R.Z.G. contó con el apoyo de los fondos del Centro Oncológico de UF Health. R.C.N. contó con el apoyo de la Subvención de Capacitación TL1 de los Institutos Nacionales de Salud de la Universidad de Florida (TL1TR001428, UL1TR001427), el Programa de Capacitación en Investigación del Cáncer Interdisciplinario Basado en Equipos del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud T32CA257923 y el Centro Oncológico de UF Health. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el UF Health Cancer Center, respaldada en parte por las asignaciones estatales provistas en Fla. Stat. § 381.915 y el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo la Adjudicación Número P30CA247796. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o del Estado de Florida. Los financiadores no desempeñaron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y el análisis; decisión de publicar; o la preparación del manuscrito.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use | Fisher Scientific | 309659 | |
1/4-28 mm thread to barbed male adaptor (3.2 mm), 5/pack | Cole-Parmer | 008NB32-KD5L | To build 1 6-well array, need 2 packs |
10M NaOH (Sodium Hydroxide) | Sigma | 72068-100ML | |
2.0ml Screw Cap Tube, NonKnurl, Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap | Fisher Scientific | 14-755-228 | |
2mag MIXdrive 60 Stirring Drive | 2mag | 40060 | 60-position magnetic stir plate (optional addition of heating capacity- cat# 40260) |
6-well reactor arrray, ABS-Like Translucent Clear plastic | Protolabs | Custom | See supplementary files for .stl file for 3D printing |
Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
Acetic acid, glacial | Sigma | A6283 | |
Adapter, nylon, male luer to 1/4-28 thread, 25/pack | Cole-Parmer | EW-45505-82 | To build 1 6-well array, need 6 (1 pack) |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
Anaerobic chamber | Coy Lab Products | Type B | |
Bel-Art SP Scienceware Flea Micro Spinbar Magnetic Stirring Bars (1/pk) | Fisher Scientific | 22-261679 | To build 1 6-well array, need 6 |
Biosafety cabinet class 2 | Nuaire | ||
Butyric acid | Sigma | B103500 | |
CaCl2 · 2H2O (Calcium Chloride Dihydrate) | Sigma | C7902 | |
Clorox Healthcare Germicidal Wipes With Bleach, Unscented, 6" x 5", Pack Of 150 Wipes | Office Depot | 129202 | |
D-(-)-Fructose | Sigma | F0127-100G | |
D-(+)-Cellobiose | Sigma | C7252-100G | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
D-(+)-Maltose monohydrate | Sigma | M5885-100G | |
Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28 | Home Depot | 305699489 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, 1X without Ca and Mg, Sterile | Genesee | 25-508 | |
Female luer × 1/16″ hose barb adapter, Nylon, 25/pack | Cole-Parmer | EW-45502-00 | To build 1 6-well array, need 24 (1 pack) |
Female luer × 1/8″ hose barb adapter, Nylon 25/pack | Cole-Parmer | EW-45502-04 | To build 1 6-well array, need 6 (1 pack) |
Female luer × 3/32″ hose barb adapter, Nylon, 25/ pack | Cole-Parmer | EW-45502-02 | To build 1 6-well array, need 6 (1 pack) |
Female luer tee, Nylon, 25/pack | Cole-Parmer | EW-45502-56 | To build 1 6-well array, need 10 (1 pack) |
FeSO4 · 7H2O (Iron [II] Sulfate Heptahydrate) | Sigma | F8633 | |
Hematin | Sigma | H3281 | |
Histidine | Sigma | H7750 | |
Isovaleric acid | Sigma | 129542 | |
K2HPO4 dibasic (dipotassium hydrogen phosphate) | Sigma | P2222-1KG | |
KH2PO4 monobasic (potassium dihydrogen phosphate) | Sigma | P0662-500G | |
Large Orifice Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-134 | |
L-Cysteine hydrochloride | Sigma | C1276-10G | |
Male luer with lock ring × 1/8″ hose barb adapter, Nylon, 25/pack | Cole-Parmer | EW-45505-04 | To build 1 6-well array, need 42 (2 packs) |
Meat extract | Sigma | 70164-500G | |
Med Vet International Exel Needle, 20G X 1", Hypodermic, 100/Box, 26417 | Fisher Scientific | 50-209-2532 | |
Menadione (Vitamin K3) | Sigma | M5625 | |
MgSO4 · 7H2O (Magnesium Sulfate Heptahydrate) | Sigma | M1880-500G | |
Milli-Q water | |||
NaCl (Sodium Chloride) | Sigma | S9888-500G | |
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Sigma | S5761-500G | |
Omnifi t Q-series two hole bottle cap | Cole-Parmer | 00945Q-2 | To build 1 6-well array, need 1 |
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V | MasterFlex | ISM939C-115V | 24-channel peristaltic pump, require 1 for source and 1 for waste |
Precision Seal® rubber septa,white, 7 mm O.D. glass tubing (100/pk) | Millipore Sigma | Z553905-100EA | To build 1 6-well array, need 6 septa |
Propionic acid | Sigma | P5561 | |
Pump Tubing, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 1.02 mm ID; 12/PK | VWR | MFLX96460-28 | To build 1 6-well array, need 6 (1 pack) |
Pump Tubing, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm ID; 12/PK | VWR | MFLX96460-30 | To build 1 6-well array, need 6 (1 pack) |
Puritan Cary-Blair Medium, 5 ml | Fisher Scientific | 22-029-646 | |
PYREX 2L Round Media Storage Bottles, with GL45 Screw Cap | Fisher Scientific | 06-414-1E | |
Razor Blades | Genesee | 12-640 | |
Resazurin, sodium salt | ACROS Organics from ThermoFisher | AC41890-0010 | |
Soluble starch | Sigma | S9765-100G | |
Stainless Steel Micro Spatulas, spoon like blade | Fisher Scientific | S50823 | |
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100' | VWR | MFLX06449-42 | To build 1 6-well array, need 205.5 cm |
Trace Mineral Supplement | ATCC | MD-TMS | |
Trypticase Peptone (BBL) | Fisher Scientific | B11921 | |
Tubing, PTFE, 1/8″ (3.2 mm) OD × 1.5 mm ID, 10 M | Cole-Parmer | 008 T32-150-10 | To build 1 6-well array, need 300 mm |
Tween 80 | Sigma | P1754 | |
Vitamin Supplement | ATCC | MD-VS | |
Yeast Extract (Bacto) | Fisher Scientific | DF0127-17-9 |
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