Modelo preclínico de exposición prenatal a delta-9-tetrahidrocannabinol para evaluar su impacto en los resultados del desarrollo neurológico

Resumen

A medida que cambian las restricciones legislativas, lo que resulta en una mayor accesibilidad a los productos cannabinoides, es de vital importancia desarrollar modelos para estudiar el impacto de estas exposiciones, especialmente durante el embarazo. Se ha desarrollado un modelo preclínico de exposición prenatal moderada a cannabinoides mediante la ingestión voluntaria, lo que permite realizar investigaciones más profundas.

Resumen

La exposición prenatal a los cannabinoides (PCE) es cada vez más frecuente a medida que más estados de los Estados Unidos legalizan la marihuana recreativa (cannabinoides). El consumo de productos cannabinoides durante el embarazo se ha asociado con varios resultados anormales, aunque los estudios históricos se realizaron durante una época en la que la potencia de estos productos era aproximadamente un 300% inferior a la de los productos actuales. Dado el creciente uso de cannabinoides, es esencial comprender los impactos potenciales que el PCE puede tener en el neurodesarrollo fetal y el posterior desarrollo de lactantes y niños. Estudios anteriores han demostrado que la PCE afecta negativamente el aprendizaje y la memoria, las habilidades conductuales, el sueño y la atención en la descendencia. El objetivo de este estudio es recapitular el PCE a través de la ingesta voluntaria de delta-9-tetrahidrocannabinol (THC), el componente psicoactivo de los productos cannabinoides, durante el embarazo en un modelo preclínico. En este artículo se describe el procedimiento para lograr una PCE moderada a lo largo de la gestación. En este modelo, el grupo de control consume galletas de mini-chocolate/mantequilla de cacahuete, mientras que el grupo PCE consume THC mezclado con mantequilla de cacahuete junto con mini-galletas de chocolate. Este enfoque permite una mayor investigación sobre el impacto de la PCE en los resultados del desarrollo.

Introducción

A medida que aumentan las tasas de uso prenatal de productos cannabinoides¹, probablemente influenciado por la creciente legalización de los productos cannabinoides en los Estados Unidos, se necesitan estudios para comprender mejor su impacto en el desarrollo fetal. El delta-9-tetrahidrocannabinol (THC), el componente psicoactivo de los productos cannabinoides, atraviesa fácilmente la placenta e interactúa con el sistema endocannabinoide endógeno ^2,3. El sistema endocannabinoide endógeno desempeña un papel fundamental en el desarrollo neuronal y puede ser una vía a través de la cual se producen alteraciones del desarrollo. El consumo de cannabinoides durante el embarazo se ha relacionado con una reducción del peso al nacer⁴ y un mayor riesgo de parto prematuro ^5,6. También se han reportado anormalidades adicionales del desarrollo, como déficits en el comportamiento social y las funciones ejecutivas a lo largo de la vida ^7,8,9.

Con el tiempo, los cambios en la potencia de los cannabinoides y los patrones de consumo en la población general han puesto de manifiesto la necesidad de realizar estudios detallados sobre los posibles efectos de la exposición prenatal en el desarrollo fetal. El uso de productos cannabinoides durante el embarazo está aumentando, ya que a menudo se percibe que estos productos alivian síntomas como la depresión, el estrés, el dolor, los trastornos del sueño y las náuseas^10,11. Dickson et ^al.12 realizaron un estudio en el que se investigaron las recomendaciones de 400 dispensarios de cannabis con respecto al consumo en el primer trimestre en Colorado y encontraron que aproximadamente la mitad de los dispensarios (50,5%) recomendaban comestibles a las personas embarazadas. A menudo se percibe que los comestibles evitan los daños y riesgos para la salud asociados con el tabaquismo^13,14, lo que resulta en que muchas personas embarazadas consuman comestibles.

Los comestibles liberan cannabinoides a través del sistema gastrointestinal, donde el THC se absorbe en el torrente sanguíneo y se transporta a través de la vena porta al hígado para el metabolismo de primer paso. En el hígado, las enzimas hidroxilan el THC para producir 11-hidroxitetrahidrocannabinol (11-OH-THC), un metabolito psicoactivo muy potente que cruza fácilmente la barrera hematoencefálica^. Aunque el efecto psicoactivo inicial de los comestibles tarda más (30-90 min), el "subidón" resultante dura más tiempo, con un pico a las 2-4 h después de la ingestión^16,17. La vida media farmacocinética del THC es de 1,3-7,3 h en ratas^18,19.

Dado el aumento de la utilización durante el embarazo y la escasez de datos sobre su impacto en el neurodesarrollo fetal, se desarrolló un modelo preclínico de la ingesta voluntaria de THC durante el embarazo, que se alinea más estrechamente con el uso humano típico reportado (consumo oral para aliviar las náuseas) para describir mejor el impacto en los resultados del desarrollo neurológico.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Nuevo México (UNM HSC). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE. Las ratas Long-Evans (Blue Spruce, HsdBlu: LE) se obtuvieron de una fuente comercial. Los machos utilizados fueron ratas reproductoras adultas probadas, de 12 semanas de edad a su llegada y de 15-16 semanas de edad al inicio del protocolo de cría. Las hembras pesaban entre 125 y 150 g y tenían aproximadamente 6-7 semanas de edad a su llegada. En el momento de la cría, las hembras tenían aproximadamente 9-10 semanas de edad. Es fundamental asegurarse de que todas las posibles madres no tengan antecedentes de embarazo. Permita al menos una semana para aclimatarse a las instalaciones y a su nuevo entorno de vivienda. La primera parte de este protocolo aborda el consumo de cannabinoides antes del embarazo, mientras que la segunda parte se centra en la exposición a los cannabinoides durante el embarazo. Los detalles de los animales, los reactivos y el equipo utilizado se proporcionan en la Tabla de Materiales. El diseño experimental se presenta en la Figura 1.

1. Exposición a cannabinoides antes del embarazo

1. Vivienda y mantenimiento
   1. Aloje a los animales individualmente en jaulas estándar de microaisladores estáticos para ratas con cama a 22 °C en un horario inverso de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas de 21:00 a 09:00 todos los días).
   2. Proporcionar acceso a alimentos irradiados (ver Tabla de Materiales) y agua del grifo ad libitum durante todo el estudio.
2. Preparación de materiales y productos químicos
   1. Obtenga todos los materiales y productos químicos requeridos (como se indica en la Tabla de Materiales).
   2. Mantenga el THC de grado de investigación en viales que contengan 10 mg/mL o 20 mg/mL de THC disuelto en etanol.
      NOTA: Utilice el equipo de protección personal (EPP) adecuado, ya que el THC es un irritante de la piel y un peligro para la aspiración. Asegure el THC en un gabinete de acero, ya que está clasificado como una sustancia controlada de la Lista I por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.
3. Mediciones de referencia
   1. Obtenga los pesos corporales de referencia para cada rata hembra.
   2. Haz una pausa en el experimento durante 1 o 2 semanas si es necesario.
4. Preparación de galletas con infusión de THC
   1. Prepare las galletas 30 minutos antes de la administración a las 14:00 todos los días para mantener horarios de alimentación constantes.
   2. Separe las mini galletas de chocolate y agregue aproximadamente media cucharadita de mantequilla de maní a la crema.
   3. Mezcle la dosis requerida de THC (1,5 mg/kg durante los primeros 2 días, seguido de 3 mg/kg durante 7 días) con la mantequilla de maní antes de armar la galleta.
5. Evaluación de consumos
   1. Proporcione una mantequilla de maní / mini galleta de chocolate durante 2-4 días hasta que se logre un consumo constante. Retire el agua de la jaula y administre la golosina a cada rata con fórceps a las 14:00 todos los días.
   2. Observe hasta que la golosina se haya consumido por completo. Retire los restos si es necesario.
      NOTA: Administrar THC a una dosis de 1,5 mg/kg durante 2 días, seguido de 3 mg/kg durante 7 días. Deje las golosinas en la jaula hasta por 2 horas para las ratas que no las consumen de inmediato.
   3. Continúe solo con ratas que muestren un consumo constante de golosinas. Elimine del experimento aquellos con una ingesta incoherente.
   4. Evaluar el consumo previo al embarazo durante 2 semanas.
6. Asignación de grupo post-PCE
   1. Asigne ratas con ingesta constante al azar al grupo de galletas simples (control) o con infusión de THC (PCE).
   2. Permita un mínimo de 4 días sin galletas antes de la cría para asegurar la eliminación de THC de sus sistemas.

2. Exposición a cannabinoides durante el embarazo (prenatal)

1. Cría y confirmación de preñez
   1. Pesa a las hembras para obtener un peso inicial antes de colocarlas en una jaula con un criador macho probado (el macho no tiene THC).
   2. Asegúrese de que las ratas hembras no consuman una galleta durante este tiempo.
   3. Confirme el embarazo por la presencia de un tapón vaginal, que generalmente ocurre 24 horas después del apareamiento.
   4. Pesa a la rata hembra y devuélvela a la jaula de casa. Esto se define como Día Gestacional (GD) 1.
2. Infusión de THC durante el embarazo
   1. Proporcione una galleta natural o con infusión de THC (3 mg / kg) a las 14:00 todos los días a partir de GD 1 durante todo el embarazo.
   2. Continúa con este régimen hasta que se observe que la madre está anidando para el parto, momento en el que se detiene la exposición al THC.
3. Seguimiento del aumento de peso materno
   1. Pesar las ratas dos veces por semana para evaluar el aumento de peso materno.
      NOTA: Los nuevos pesos también se utilizan para calcular la cantidad de THC que se debe incluir en la galleta, ajustando la dosis según sea necesario en función del peso de la madre.
4. Cese de la exposición al THC y documentación del nacimiento
   1. Detenga los procedimientos de exposición al THC cuando la madre esté anidando alrededor del momento esperado de parto.
   2. Una vez que nazcan las crías, registre el número de cachorros vivos.
   3. Designe el día de nacimiento como día postnatal (P) 0.
5. Destete y alojamiento de las crías
   1. Destetar a las crías en el día postnatal (P) 23.
   2. El grupo aloja a las crías destetadas con compañeros de camada en función del sexo.
6. Eutanasia de presas
   1. Una vez que la camada es destetada, se sacrifica a las madres siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente.

3. Etapas posteriores al procedimiento

1. Alojamiento y seguimiento de las crías
   1. Asegúrese de que todas las crías se mantengan en condiciones de alojamiento adecuadas, asegurando la temperatura, la luz y la ventilación adecuadas.
   2. Monitoree a los cachorros con regularidad para detectar cualquier problema de salud o desarrollo, como peso corporal anormal o retrasos en el desarrollo.
2. Evaluación de referencia
   1. Si es necesario, evalúe las medidas de referencia, como el peso corporal, los reflejos u otros parámetros de desarrollo relevantes, antes de iniciar experimentos con la descendencia.
3. Asignación de grupos experimentales
   1. Asigne cachorros a grupos experimentales de forma aleatoria para minimizar cualquier sesgo en las pruebas.
   2. Limite el número de crías utilizadas por experimento a 1-2 crías de cada camada para reducir los posibles efectos de la camada.

Resultados

Para establecer el consumo voluntario de THC, se probaron numerosas golosinas para determinar cuáles eran apetecibles para las ratas y cuáles se consumirían de forma rápida y constante.

Inicialmente, se probaron cubos de gelatina con sabor a fresa sin azúcar (tamaño de 1 ml cúbico), con y sin THC. Se aumentó la cantidad de saborizante de jarabe de fresa y se probó el THC en tres concentraciones diferentes (2 mg/kg/dosis, 3 mg/kg/dosis y 5 mg/kg/dosis)...

Discusión

El paradigma PCE descrito aquí implica el consumo voluntario de THC por parte de ratas preñadas. Este es el primer estudio que explora la administración de THC a madres de ratas embarazadas a través de la ingestión voluntaria en un modelo preclínico. Ambos grupos de ratas consumieron la misma dieta de rata chow, minimizando la posible variabilidad en la nutrición y la ingesta calórica entre los grupos. Los modelos animales ofrecen la ventaja de controlar el momento y la dosis de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5L0D PicoLab Laboratory Rodent Diet, irradiated	Purina LabDiet	5L0D
Cellulose/paper bedding BioFresh Comfort Bedding	BioFresh Vet	NA	https://biofreshvet.com/products/
Digital Kitchen Scale	Etekcity	EK4150
Female rats, 125-150 g	Inotiv	14005F
Long-Evans rats (Blue Spruce, HsdBlu: LE)	Inotiv	14016M
N10 Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	N10PLF
N10 Rodent Wire Lids	Ancare	N10SS
Narrow Pattern Forceps	Fine Science tools (FST)	11002-14
OREO mini chocolate Sandwich cookies, Go Paks, 12-3.5 oz cups	Amazon	B0198TUO7W
proven adult breeder males	Inotiv	14016M
Rat static polysulfone microisolator cages (R20):
Research Grade THC  (only available with a DEA license, Schedule I drug)	NIDA	NA	https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program
SKIPPY Creamy Peanut Butter spread	Amazon	B0C75KZ28C
THC Consumption Supplies: