Modello preclinico di esposizione prenatale al delta-9-tetraidrocannabinolo per valutarne l'impatto sugli esiti dello sviluppo neurologico

Riepilogo

Poiché le restrizioni legislative cambiano, con conseguente aumento dell'accessibilità dei prodotti a base di cannabinoidi, è di fondamentale importanza sviluppare modelli per studiare l'impatto di queste esposizioni, in particolare durante la gravidanza. È stato sviluppato un modello preclinico di esposizione prenatale moderata ai cannabinoidi attraverso l'ingestione volontaria, che consente indagini più approfondite.

Abstract

L'esposizione prenatale ai cannabinoidi (PCE) sta diventando sempre più frequente poiché sempre più stati negli Stati Uniti legalizzano la marijuana ricreativa (cannabinoidi). Il consumo di prodotti a base di cannabinoidi durante la gravidanza è stato associato a vari esiti anomali, sebbene gli studi storici siano stati condotti durante un periodo in cui la potenza di questi prodotti era inferiore di circa il 300% rispetto a quella dei prodotti attuali. Dato il crescente uso di cannabinoidi, è essenziale comprendere i potenziali impatti che la PCE può avere sullo sviluppo neurologico fetale e sul successivo sviluppo di neonati e bambini. Studi precedenti hanno dimostrato che la PCE influisce negativamente sull'apprendimento e sulla memoria, sulle abilità comportamentali, sul sonno e sull'attenzione nella prole. Lo scopo di questo studio è quello di ricapitolare la PCE attraverso l'ingestione volontaria di delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), il componente psicoattivo dei prodotti cannabinoidi, durante la gravidanza in un modello preclinico. Questo articolo delinea la procedura per ottenere una PCE moderata durante la gestazione. In questo modello, il gruppo di controllo consuma semplici biscotti al cioccolato/burro di arachidi, mentre il gruppo PCE consuma THC mescolato al burro di arachidi abbinato a mini-biscotti al cioccolato. Questo approccio consente ulteriori indagini sull'impatto della PCE sugli esiti dello sviluppo.

Introduzione

Con^{l'aumento dei} tassi di consumo prenatale di cannabinoidi, probabilmente influenzati dalla crescente legalizzazione dei prodotti a base di cannabinoidi negli Stati Uniti, sono necessari studi per comprendere meglio il loro impatto sullo sviluppo fetale. Il delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), il componente psicoattivo dei prodotti cannabinoidi, attraversa facilmente la placenta e interagisce con il sistema endocannabinoide endogeno ^2,3. Il sistema endocannabinoide endogeno svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo neurale e può essere un percorso attraverso il quale si verificano alterazioni dello sviluppo. L'uso di cannabinoidi durante la gravidanza è stato collegato a una riduzione del peso alla nascita⁴ e a un aumento del rischio di parto prematuro ^5,6. Sono^{state riportate anche} ulteriori anomalie dello sviluppo, come deficit nel comportamento sociale e nelle funzioni esecutive per tutta la vita.

Nel corso del tempo, i cambiamenti nella potenza dei cannabinoidi e nei modelli di utilizzo nella popolazione generale hanno evidenziato la necessità di studi dettagliati sui potenziali effetti dell'esposizione prenatale sullo sviluppo fetale. L'uso di prodotti a base di cannabinoidi durante la gravidanza è in aumento, poiché questi prodotti sono spesso percepiti per alleviare sintomi come depressione, stress, dolore, disturbi del sonno e nausea^10,11. Dickson et ^al.12 hanno condotto uno studio che ha esaminato le raccomandazioni di 400 dispensari di cannabis riguardo all'uso nel primo trimestre in Colorado e hanno scoperto che circa la metà dei dispensari (50,5%) raccomandava gli edibili alle persone in gravidanza. Spesso si percepisce che gli edibili evitano i danni e i rischi per la salute associati al fumo^13,14, il che si traduce in molte persone incinte che consumano edibili.

Gli edibili forniscono cannabinoidi attraverso il sistema gastrointestinale, dove il THC viene assorbito nel flusso sanguigno e trasportato attraverso la vena porta al fegato per il metabolismo di primo passaggio. Nel fegato, gli enzimi idrossilano il THC per produrre 11-idrossitetraidrocannabinolo (11-OH-THC), un metabolita psicoattivo altamente potente che attraversa facilmente la barriera emato-encefalica¹⁵. Sebbene ci voglia più tempo per l'effetto psicoattivo iniziale degli edibili (30-90 min), lo "sballo" risultante dura più a lungo, con un picco a 2-4 ore dopo l'ingestione^16,17. L'emivita farmacocinetica del THC è di 1,3-7,3 ore nei ratti^18,19.

Dato il crescente utilizzo durante la gravidanza e la scarsità di dati sul suo impatto sullo sviluppo neurologico fetale, è stato sviluppato un modello preclinico di ingestione volontaria di THC durante la gravidanza, allineandosi più strettamente con l'uso umano tipico riportato (consumo orale per alleviare la nausea) per descrivere ulteriormente l'impatto sugli esiti dello sviluppo neurologico.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del New Mexico Health Sciences Center (UNM HSC). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE. I ratti Long-Evans (Blue Spruce, HsdBlu: LE) sono stati ottenuti da una fonte commerciale. I maschi utilizzati erano ratti adulti da riproduzione, di 12 settimane all'arrivo e di 15-16 settimane all'inizio del protocollo di riproduzione. Le femmine pesavano 125-150 g e avevano circa 6-7 settimane di età all'arrivo. Al momento della riproduzione, le femmine avevano circa 9-10 settimane. È fondamentale assicurarsi che tutte le potenziali madri non abbiano precedenti di gravidanza. Prevedere almeno una settimana per l'acclimatamento alla struttura e al nuovo ambiente abitativo. La prima parte di questo protocollo affronta il consumo di cannabinoidi prima della gravidanza, mentre la seconda parte si concentra sull'esposizione ai cannabinoidi in gravidanza. I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali. Il disegno sperimentale è fornito nella Figura 1.

1. Esposizione ai cannabinoidi prima della gravidanza

1. Alloggio e manutenzione
   1. Alloggiare gli animali individualmente in gabbie standard con lettiera statica per ratti con lettiera a 22 °C con un programma inverso di luce/buio di 12 ore (luci accese tutti i giorni dalle 21:00 alle 09:00).
   2. Fornire l'accesso al cibo irradiato (vedi Tabella dei materiali) e all'acqua del rubinetto ad libitum durante lo studio.
2. Materiale e preparazione chimica
   1. Procurarsi tutti i materiali e i prodotti chimici necessari (come indicato nella Tabella dei materiali).
   2. Conserva il THC per la ricerca in fiale contenenti 10 mg/mL o 20 mg/mL di THC disciolto in etanolo.
      NOTA: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, poiché il THC è irritante per la pelle e un pericolo per l'aspirazione. Metti al sicuro il THC in un armadio d'acciaio, poiché è classificato come sostanza controllata dalla Tabella I dal Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani degli Stati Uniti e dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti.
3. Misurazioni di base
   1. Ottenere il peso corporeo di base per ogni ratto femmina.
   2. Se necessario, metti in pausa l'esperimento qui per 1-2 settimane.
4. Preparazione di biscotti infusi di THC
   1. Preparare i biscotti 30 minuti prima della somministrazione alle 14:00 tutti i giorni per mantenere orari di alimentazione coerenti.
   2. Separare i mini biscotti al cioccolato e aggiungere circa mezzo cucchiaino di burro di arachidi alla crema.
   3. Mescola la dose richiesta di THC (1,5 mg/kg per i primi 2 giorni, seguita da 3 mg/kg per 7 giorni) con il burro di arachidi prima di assemblare il biscotto.
5. Valutazione dei consumi
   1. Fornire un semplice biscotto al burro di arachidi/mini cioccolato per 2-4 giorni fino a raggiungere un consumo costante. Rimuovi l'acqua dalla gabbia e somministra il bocconcino a ciascun ratto usando il forcipe alle 14:00 ogni giorno.
   2. Osservare fino a quando il bocconcino non è completamente consumato. Rimuovere i resti se necessario.
      NOTA: Somministrare THC alla dose di 1,5 mg/kg per 2 giorni, seguito da 3 mg/kg per 7 giorni. Lasciare i bocconcini nella gabbia per un massimo di 2 ore per i ratti che non li consumano immediatamente.
   3. Continuare solo con i ratti che mostrano un consumo costante di bocconcini. Rimuovere dall'esperimento quelli con ingestione incoerente.
   4. Valutare il consumo pre-gravidanza per 2 settimane.
6. Assegnazione di gruppo post-PCE
   1. Assegna i ratti con ingestione costante in modo casuale al gruppo di biscotti semplici (di controllo) o infusi di THC (PCE).
   2. Consentire un minimo di 4 giorni senza biscotti prima dell'allevamento per garantire l'eliminazione del THC dai loro sistemi.

2. Esposizione ai cannabinoidi in gravidanza (prenatale)

1. Allevamento e conferma della gravidanza
   1. Pesa le femmine per ottenere un peso iniziale prima di metterle in una gabbia con un riproduttore maschio provato (il maschio è naïve al THC).
   2. Assicurati che le femmine di ratto non consumino un biscotto durante questo periodo.
   3. Confermare la gravidanza con la presenza di un tappo vaginale, che in genere si verifica 24 ore dopo l'accoppiamento.
   4. Pesa la femmina di ratto e rimettila nella gabbia di casa. Questo è definito come Giorno gestazionale (GD) 1.
2. Infusione di THC durante la gravidanza
   1. Fornire un biscotto semplice o infuso di THC (3 mg/kg) alle 14:00 ogni giorno a partire da GD 1 per tutta la durata della gravidanza.
   2. Continuate questo regime fino a quando non si nota che la madre sta nidificando per il parto, a quel punto l'esposizione al THC viene interrotta.
3. Monitoraggio dell'aumento di peso materno
   1. Pesare le dighe dei ratti due volte a settimana per valutare l'aumento di peso materno.
      NOTA: I nuovi pesi vengono utilizzati anche per calcolare la quantità di THC da includere nel biscotto, regolando la dose secondo necessità in base al peso della madre.
4. Cessazione dell'esposizione al THC e documentazione del parto
   1. Interrompere le procedure di esposizione al THC quando la diga nidifica intorno all'orario previsto per il parto.
   2. Una volta nata la prole, registra il numero di cuccioli vivi.
   3. Designare il giorno di nascita come giorno postnatale (P) 0.
5. Svezzamento e stabulazione della prole
   1. Svezzare la prole nel giorno postnatale (P) 23.
   2. Il gruppo ospita la prole svezzata con compagni di cucciolata in base al sesso.
6. Eutanasia delle dighe
   1. Una volta che la cucciolata è stata svezzata, sopprimere le madri seguendo protocolli istituzionalmente approvati.

3. Fasi post-procedurali

1. Stabulazione e monitoraggio della prole
   1. Assicurarsi che tutta la prole sia tenuta in condizioni di stabulazione adeguate, garantendo temperatura, luce e ventilazione adeguate.
   2. Monitora regolarmente i cuccioli per eventuali problemi di salute o di sviluppo, come peso corporeo anormale o ritardi nello sviluppo.
2. Valutazione di base
   1. Se necessario, valutare le misure di base come il peso corporeo, i riflessi o altri parametri di sviluppo rilevanti prima di iniziare gli esperimenti sulla prole.
3. Assegnazione di gruppo sperimentale
   1. Assegna i cuccioli ai gruppi sperimentali in modo casuale per ridurre al minimo eventuali distorsioni nei test.
   2. Limita il numero di cuccioli utilizzati per esperimento a 1-2 cuccioli per ogni cucciolata per ridurre i potenziali effetti della cucciolata.

Risultati

Per stabilire il consumo volontario di THC, sono stati sperimentati numerosi bocconcini per determinare quali fossero appetibili per i ratti e sarebbero stati consumati rapidamente e costantemente.

Inizialmente, sono stati sperimentati cubetti di gelatina al gusto di fragola senza zucchero (1 ml cubo), sia con che senza THC. La quantità di aroma di sciroppo di fragole è stata aumentata e il THC è stato testato a tre diverse concentrazioni (2 mg/kg/dose, 3 m...

Discussione

Il paradigma PCE qui delineato prevede il consumo volontario di THC da parte di madri di ratti gravide. Questo è il primo studio ad esplorare la somministrazione di THC a madri di ratti gravide tramite ingestione volontaria in un modello preclinico. Entrambi i gruppi di madri di ratti hanno consumato la stessa dieta a base di cibo per ratti, riducendo al minimo la potenziale variabilità nella nutrizione e nell'apporto calorico tra i gruppi. I modelli animali offrono il vantaggio di con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5L0D PicoLab Laboratory Rodent Diet, irradiated	Purina LabDiet	5L0D
Cellulose/paper bedding BioFresh Comfort Bedding	BioFresh Vet	NA	https://biofreshvet.com/products/
Digital Kitchen Scale	Etekcity	EK4150
Female rats, 125-150 g	Inotiv	14005F
Long-Evans rats (Blue Spruce, HsdBlu: LE)	Inotiv	14016M
N10 Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	N10PLF
N10 Rodent Wire Lids	Ancare	N10SS
Narrow Pattern Forceps	Fine Science tools (FST)	11002-14
OREO mini chocolate Sandwich cookies, Go Paks, 12-3.5 oz cups	Amazon	B0198TUO7W
proven adult breeder males	Inotiv	14016M
Rat static polysulfone microisolator cages (R20):
Research Grade THC  (only available with a DEA license, Schedule I drug)	NIDA	NA	https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program
SKIPPY Creamy Peanut Butter spread	Amazon	B0C75KZ28C
THC Consumption Supplies: