신경 발달 결과에 미치는 영향을 평가하기 위한 태아 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 노출의 전임상 모델

요약

법적 제한이 변경되어 카나비노이드 제품에 대한 접근성이 높아짐에 따라 특히 임신 중 이러한 노출의 영향을 연구하기 위한 모델을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 자발적 섭취를 통한 중등도의 산전 카나비노이드 노출에 대한 전임상 모델이 개발되어 보다 심층적인 조사가 가능해졌습니다.

초록

미국 전역의 더 많은 주에서 레크리에이션 마리화나(카나비노이드)를 합법화함에 따라 태아 카나비노이드 노출(PCE)이 점점 더 빈번해지고 있습니다. 임신 중 카나비노이드 제품의 소비는 다양한 비정상적인 결과와 관련이 있지만, 역사적 연구는 이러한 제품의 효능이 현재 제품보다 약 300 % 낮았을 때 수행되었습니다. 칸 나비 노이드의 사용이 증가함에 따라 PCE가 태아의 신경 발달과 이후의 영아 및 아동 발달에 미칠 수있는 잠재적 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 이전 연구에서는 PCE가 자손의 학습과 기억, 행동 기술, 수면 및 주의력에 부정적인 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 이 연구의 목적은 임신 중 카나비노이드 제품의 향정신성 성분인 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(THC)의 자발적 섭취를 통해 PCE를 전임상 모델로 요약하는 것입니다. 이 기사에서는 임신 기간 동안 중등도의 PCE를 달성하기 위한 절차를 간략하게 설명합니다. 이 모델에서 대조군은 일반 미니 초콜릿/땅콩 버터 쿠키를 섭취하는 반면, PCE 그룹은 미니 초콜릿 쿠키와 짝을 이루는 땅콩 버터에 혼합된 THC를 섭취합니다. 이 접근법을 통해 PCE가 발달 결과에 미치는 영향에 대한 추가 조사를 수행할 수 있습니다.

서문

산전 카나비노이드 제품 사용률이 증가함에 따라¹ 미국 전역에서 카나비노이드 제품의 합법화가 증가함에 따라 태아 발달에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위한 연구가 필요합니다. 칸나비노이드 제품의 향정신성 성분인 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(THC)은 태반을 쉽게 통과하여 내인성 엔도칸나비노이드 시스템과 상호 작용합니다 ^2,3. 내인성 엔도칸나비노이드 시스템은 신경 발달에 중요한 역할을 하며 발달 변화가 발생하는 경로일 수 있습니다. 임신 중 카나비노이드 사용은 체중 감소와 관련이 있으며,⁴ 및 조산 위험 증가와 관련이 있으며^{, 5,6}. 일생 동안 사회적 행동 및 집행 기능의 결핍과 같은 추가적인 발달 이상도 보고되었다 ^7,8,9.

시간이 지남에 따라 일반 인구 집단에서 카나비노이드 효능과 사용 패턴의 변화로 인해 태아 노출이 태아 발달에 미치는 잠재적 영향에 대한 자세한 연구의 필요성이 강조되었습니다. 임신 중 카나비노이드 제품의 사용은 우울증, 스트레스, 통증, 수면 장애 및 메스꺼움과 같은 증상을 완화하는 것으로 인식되는 경우가 많기 때문에 증가하고 있습니다^10,11. Dickson et ^al.12은 콜로라도에서 임신 초기에 사용하는 것에 관한 400 개의 대마초 약국의 권장 사항을 조사하는 연구를 수행했으며 약국의 약 절반 (50.5 %)이 임산부에게 식용을 권장한다는 것을 발견했습니다. 식용은 흡연과 관련된 해로움 및 건강 위험을 피하는 것으로 종종 인식되며^{, 13,14} 이로 인해 많은 임산부가 식용을 섭취하게 됩니다.

식용은 THC가 혈류로 흡수되고 1 차 통과 신진 대사를 위해 문맥을 통해 간으로 운반되는 위장 시스템을 통해 칸 나비 노이드를 전달합니다. 간에서 효소는 THC를 수산화하여 혈액 뇌 장벽을 쉽게 통과하는 매우 강력한 향정신성 대사 산물인 11-하이드록시테트라하이드로칸나비놀(11-OH-THC)을 생성합니다¹⁵. 식용의 초기 정신 자극 효과 (30-90 분)는 더 오래 걸리지만, 결과적으로 '높음'은 더 오래 지속되며 섭취 후 2-4 시간에 최고조에 달합니다^16,17. THC의 약동학 반감기는 쥐^18,19에서 1.3-7.3 시간입니다.

임신 중 THC 섭취가 증가하고 태아의 신경 발달에 미치는 영향에 대한 데이터가 부족하다는 점을 감안하여 임신 중 자발적 THC 섭취의 전임상 모델이 개발되었으며, 이는 신경 발달 결과에 미치는 영향을 추가로 설명하기 위해 보고된 일반적인 인간 사용(메스꺼움을 완화하기 위한 경구 섭취)과 더 밀접하게 일치합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 절차는 뉴멕시코 대학교 보건 과학 센터(UNM HSC) 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. Long-Evans (Blue Spruce, HsdBlu : LE) 쥐는 상업적 출처에서 얻었습니다. 사용 된 수컷은 도착시 12 주, 번식 프로토콜이 시작될 때 15-16 주령의 입증 된 성인 사육 쥐였습니다. 암컷의 체중은 125-150g이었고 도착했을 때 약 6-7주였습니다. 번식 당시 암컷은 약 9-10주였습니다. 모든 예비 댐에 이전 임신 이력이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 시설과 새로운 주거 환경에 적응하는 데 최소 일주일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 임신 전 카나비노이드 소비를 다루고 두 번째 부분은 임신 카나비노이드 노출에 초점을 맞춥니다. 사용된 동물, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다. 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 임신 전 카나비노이드 노출

1. 주거 및 유지 보수
   1. 22 ° C에서 침구가있는 표준 쥐 정적 마이크로 절연 케이지에 동물을 개별적으로 수용 12 시간 라이트 / 다크 일정 (매일 21:00부터 09:00까지 점등).
   2. 연구 전반에 걸쳐 방사선 조사된 음식(재료 표 참조)과 수돗물에 대한 접근을 제공합니다.
2. 재료 및 화학 제제
   1. 필요한 모든 재료와 화학 물질을 얻습니다( 재료표에 제공된 대로).
   2. 에탄올에 용해된 10mg/mL 또는 20mg/mL THC가 포함된 바이알에 연구 등급 THC를 보관하십시오.
      알림: THC는 피부 자극성 및 흡인 위험이므로 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. THC는 미국 보건 복지부(Department of Health and Human Services)와 미국 식품의약국(FDA)에서 Schedule I 규제 물질로 분류되므로 강철 캐비닛에 보관하십시오.
3. 기준선 측정
   1. 각 암컷 쥐의 기준 체중을 구합니다.
   2. 필요한 경우 여기에서 1-2주 동안 실험을 일시 중지합니다.
4. THC 주입 쿠키의 준비
   1. 일관된 수유 시간을 유지하기 위해 매일 14:00에 투여 30분 전에 쿠키를 준비하십시오.
   2. 미니 초콜릿 쿠키를 분리하고 크림에 땅콩 버터 반 티스푼 정도를 넣으십시오.
   3. 쿠키를 조립하기 전에 필요한 용량의 THC(처음 2일 동안 1.5mg/kg, 이후 7일 동안 3mg/kg)를 땅콩 버터와 혼합합니다.
5. 소비량 평가
   1. 꾸준한 섭취가 이루어질 때까지 2-4일 동안 일반 땅콩 버터/미니 초콜릿 쿠키를 제공하십시오. 케이지에서 물을 제거하고 매일 14:00에 집게를 사용하여 각 쥐에게 간식을 투여합니다.
   2. 간식이 완전히 소모될 때까지 관찰하십시오. 필요한 경우 잔여물을 제거합니다.
      참고 : THC를 1.5 일 동안 2 mg / kg의 용량으로 투여 한 다음 7 일 동안 3 mg / kg을 투여합니다. 즉시 먹지 않는 쥐를 위해 최대 2시간 동안 케이지에 간식을 두십시오.
   3. 꾸준한 간식 섭취를 보이는 쥐에게만 계속하십시오. 일관되지 않은 수집이 있는 사용자를 실험에서 삭제합니다.
   4. 2주 동안 임신 전 섭취량을 평가합니다.
6. PCE 이후 그룹 배정
   1. 일관된 섭취를 가진 쥐를 일반(대조군) 또는 THC 주입(PCE) 쿠키 그룹에 무작위로 할당합니다.
   2. 시스템에서 THC 제거를 보장하기 위해 번식 전에 쿠키없이 최소 4 일을 허용하십시오.

2. 임신 (태아기) 카나비노이드 노출

1. 번식 및 임신 확인
   1. 검증된 수컷 사육사와 함께 새장에 넣기 전에 암컷의 무게를 측정하여 시작 체중을 구합니다(수컷은 THC 순진함).
   2. 이 시간 동안 암컷 쥐가 쿠키를 먹지 않도록 하십시오.
   3. 일반적으로 짝짓기 후 24시간 후에 발생하는 질 플러그의 존재로 임신을 확인합니다.
   4. 암컷 쥐의 무게를 잰 다음 집 우리로 되돌립니다. 이는 재태일(GD) 1로 정의됩니다.
2. 임신 중 THC 주입
   1. 임신 기간 동안 GD 1부터 매일 14:00에 일반 또는 THC 주입(3mg/kg) 쿠키를 제공하십시오.
   2. 댐이 분만을 위해 둥지를 틀고 있는 것으로 표시될 때까지 이 요법을 계속하면 THC 노출이 중지됩니다.
3. 산모의 체중 증가 모니터링
   1. 모계의 체중 증가를 평가하기 위해 일주일에 두 번 쥐댐의 무게를 잰다.
      참고: 새로운 가중치는 쿠키에 포함할 THC의 양을 계산하는 데에도 사용되며 댐의 무게에 따라 필요에 따라 복용량을 조정합니다.
4. THC 노출 중단 및 출생 서류
   1. 댐이 예상 배송 시간에 둥지를 틀 때 THC 노출 절차를 중지하십시오.
   2. 자손이 태어나면 살아있는 새끼의 수를 기록하십시오.
   3. 생년월일을 산후일(P)0로 지정한다.
5. 젖을 떼고 자손을 기르는 것
   1. 출산 후 날에 자손을 젖을 뗀다 (P) 23.
   2. 집단 사육은 젖을 뗀 자손을 성별에 따라 새끼를 낳는다.
6. 댐의 안락사
   1. 깔짚이 젖을 떼면 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 댐을 안락사시킵니다.

3. 사후 절차 단계

1. 자손 사육 및 모니터링
   1. 모든 자손이 적절한 주거 조건에서 유지되고 적절한 온도, 조명 및 환기를 보장하도록 합니다.
   2. 비정상적인 체중이나 발달 지연과 같은 건강 또는 발달 문제에 대해 강아지를 정기적으로 모니터링하십시오.
2. 기준 평가
   1. 필요한 경우, 자손에 대한 실험을 시작하기 전에 체중, 반사 신경 또는 기타 관련 발달 매개변수와 같은 기준선 측정을 평가합니다.
3. 실험 그룹 할당
   1. 테스트의 편향을 최소화하기 위해 강아지를 실험 그룹에 무작위로 할당합니다.
   2. 실험당 사용되는 새끼의 수를 각 새끼에서 1-2마리로 제한하여 잠재적인 새끼 효과를 줄이십시오.

결과

THC의 자발적인 소비를 확립하기 위해, 어떤 간식이 쥐의 입맛에 맞고 빠르고 일관되게 소비되는지 결정하기 위해 수많은 간식을 시험했습니다.

처음에는 THC가 있거나 없는 무설탕 딸기 맛 젤라틴 큐브(1입방mL 크기)를 시험했습니다. 딸기 시럽 향료의 양을 늘리고 THC를 세 가지 농도 (2mg / kg / 용량, 3mg / kg / 용량 및 5mg / kg / 용량)로 시험했습니다. 쥐는 ...

토론

여기에 요약된 PCE 패러다임은 임신한 쥐댐에 의한 자발적인 THC 소비를 포함합니다. 이것은 전임상 모델에서 자발적 섭취를 통해 임신 한 쥐댐에 THC를 투여하는 방법을 탐구 한 최초의 연구입니다. 두 그룹의 쥐댐은 동일한 쥐댐 식단을 섭취하여 그룹 간의 영양 및 칼로리 섭취의 잠재적 변동을 최소화했습니다. 동물 모델은 연구 목적으로 PCE의 시기와 투여량을 제어할 수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5L0D PicoLab Laboratory Rodent Diet, irradiated	Purina LabDiet	5L0D
Cellulose/paper bedding BioFresh Comfort Bedding	BioFresh Vet	NA	https://biofreshvet.com/products/
Digital Kitchen Scale	Etekcity	EK4150
Female rats, 125-150 g	Inotiv	14005F
Long-Evans rats (Blue Spruce, HsdBlu: LE)	Inotiv	14016M
N10 Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	N10PLF
N10 Rodent Wire Lids	Ancare	N10SS
Narrow Pattern Forceps	Fine Science tools (FST)	11002-14
OREO mini chocolate Sandwich cookies, Go Paks, 12-3.5 oz cups	Amazon	B0198TUO7W
proven adult breeder males	Inotiv	14016M
Rat static polysulfone microisolator cages (R20):
Research Grade THC  (only available with a DEA license, Schedule I drug)	NIDA	NA	https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program
SKIPPY Creamy Peanut Butter spread	Amazon	B0C75KZ28C
THC Consumption Supplies: