Präklinisches Modell der pränatalen Delta-9-Tetrahydrocannabinol-Exposition zur Bewertung ihrer Auswirkungen auf die neurologischen Entwicklungsergebnisse

Zusammenfassung

Da sich die gesetzlichen Beschränkungen ändern, was zu einer besseren Zugänglichkeit von Cannabinoidprodukten führt, ist es von entscheidender Bedeutung, Modelle zu entwickeln, um die Auswirkungen dieser Expositionen, insbesondere während der Schwangerschaft, zu untersuchen. Es wurde ein präklinisches Modell der moderaten pränatalen Cannabinoid-Exposition durch freiwillige Einnahme entwickelt, das tiefergehende Untersuchungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die pränatale Cannabinoid-Exposition (PCE) wird immer häufiger, da immer mehr Bundesstaaten in den Vereinigten Staaten Freizeit-Marihuana (Cannabinoide) legalisieren. Der Konsum von Cannabinoidprodukten während der Schwangerschaft wurde mit verschiedenen abnormalen Ergebnissen in Verbindung gebracht, obwohl historische Studien zu einer Zeit durchgeführt wurden, in der die Wirksamkeit dieser Produkte etwa 300% niedriger war als die der aktuellen Produkte. Angesichts des zunehmenden Konsums von Cannabinoiden ist es wichtig, die potenziellen Auswirkungen von PCE auf die neurologische Entwicklung des Fötus und die anschließende Entwicklung von Säuglingen und Kindern zu verstehen. Frühere Studien haben gezeigt, dass PCE das Lernen und das Gedächtnis, die Verhaltensfähigkeiten, den Schlaf und die Aufmerksamkeit der Nachkommen negativ beeinflusst. Das Ziel dieser Studie ist es, PCE durch freiwillige Einnahme von Delta-9-Tetrahydrocannabinol (THC), der psychoaktiven Komponente von Cannabinoidprodukten, während der Schwangerschaft in einem präklinischen Modell zu rekapitulieren. In diesem Artikel wird das Verfahren zum Erreichen einer moderaten PCE während der gesamten Schwangerschaft beschrieben. In diesem Modell konsumiert die Kontrollgruppe einfache Mini-Schokoladen-/Erdnussbutterkekse, während die PCE-Gruppe THC in Erdnussbutter gemischt in Kombination mit Mini-Schokoladenkeksen konsumiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine weitere Untersuchung des Einflusses von PCE auf die Entwicklungsergebnisse.

Einleitung

Da die Konsumraten von pränatalen Cannabinoidprodukten^{zunehmen 1}, wahrscheinlich beeinflusst durch die zunehmende Legalisierung von Cannabinoidprodukten in den Vereinigten Staaten, sind Studien erforderlich, um ihre Auswirkungen auf die Entwicklung des Fötus besser zu verstehen. Delta-9-Tetrahydrocannabinol (THC), die psychoaktive Komponente von Cannabinoidprodukten, durchdringt leicht die Plazenta und interagiert mit dem endogenen Endocannabinoid-System ^2,3. Das endogene Endocannabinoid-System spielt eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und kann ein Weg sein, über den Entwicklungsveränderungen auftreten. Der Konsum von Cannabinoiden während der Schwangerschaft wurde mit einem verringerten Geburtsgewicht⁴ und einem erhöhten Risiko für Frühgeburten in Verbindung gebracht ^5,6. Zusätzliche Entwicklungsanomalien, wie z. B. Defizite im Sozialverhalten und in den exekutiven Funktionen während des gesamten Lebens, wurden ebenfalls berichtet ^7,8,9.

Im Laufe der Zeit haben Veränderungen in der Cannabinoid-Potenz und den Konsummustern in der Allgemeinbevölkerung die Notwendigkeit detaillierter Studien über die möglichen Auswirkungen einer pränatalen Exposition auf die Entwicklung des Fötus hervorgehoben. Die Verwendung von Cannabinoid-Produkten während der Schwangerschaft nimmt zu, da diese Produkte oft als Linderung von Symptomen wie Depressionen, Stress, Schmerzen, Schlafstörungen und Übelkeit wahrgenommen werden ^10,11. Dickson et ^al.12 führten eine Studie durch, in der die Empfehlungen von 400 Cannabis-Apotheken in Colorado bezüglich des Konsums im ersten Trimester untersucht wurden, und fanden heraus, dass etwa die Hälfte der Apotheken (50,5 %) schwangeren Personen Esswaren empfahl. Es wird oft angenommen, dass Esswaren Schäden und Gesundheitsrisiken vermeiden, die mit dem Rauchen verbunden sind^13,14, was dazu führt, dass viele schwangere Personen Esswaren konsumieren.

Esswaren liefern Cannabinoide über das Magen-Darm-System, wo THC in den Blutkreislauf aufgenommen und über die Pfortader zur Leber transportiert wird, wo der First-Pass-Stoffwechsel stattfindet. In der Leber hydroxylieren Enzyme THC zu 11-Hydroxytetrahydrocannabinol (11-OH-THC), einem hochwirksamen psychoaktiven Metaboliten, der die Blut-Hirn-Schranke leicht überwindet¹⁵. Obwohl es länger dauert, bis die erste psychoaktive Wirkung von Edibles einsetzt (30-90 Minuten), hält das resultierende "High" länger an, mit einem Höhepunkt bei 2-4 Stunden nach der Einnahme ^16,17. Die pharmakokinetische Halbwertszeit von THC beträgt bei Ratten 1,3-7,3 h^18,19.

Angesichts der zunehmenden Nutzung während der Schwangerschaft und des Mangels an Daten über seine Auswirkungen auf die neurologische Entwicklung des Fötus wurde ein präklinisches Modell der freiwilligen THC-Einnahme während der Schwangerschaft entwickelt, das sich stärker an der berichteten typischen Anwendung beim Menschen (oraler Konsum zur Linderung von Übelkeit) orientiert, um die Auswirkungen auf die neurologischen Entwicklungsergebnisse weiter zu beschreiben.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Health Sciences Center der University of New Mexico (UNM HSC) genehmigt. Alle Versuche wurden unter Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Long-Evans-Ratten (Blaufichte, HsdBlu: LE) wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen. Bei den verwendeten Männchen handelte es sich um nachweislich erwachsene Zuchtratten, die bei der Ankunft 12 Wochen alt waren und zu Beginn des Zuchtprotokolls 15-16 Wochen alt waren. Die Weibchen wogen 125-150 g und waren bei der Ankunft etwa 6-7 Wochen alt. Zum Zeitpunkt der Zucht waren die Weibchen etwa 9-10 Wochen alt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle potenziellen Muttertiere keine Schwangerschaft in der Vorgeschichte haben. Planen Sie mindestens eine Woche ein, um sich an die Einrichtung und ihre neue Wohnumgebung zu gewöhnen. Der erste Teil dieses Protokolls befasst sich mit dem Cannabinoidkonsum vor der Schwangerschaft, während sich der zweite Teil auf die Exposition gegenüber Cannabinoiden in der Schwangerschaft konzentriert. Einzelheiten zu den verwendeten Tieren, Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Das Versuchsdesign ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Cannabinoid-Exposition vor der Schwangerschaft

1. Gehäuse und Wartung
   1. Die Tiere werden einzeln in statischen Standard-Mikroisolatorkäfigen von Ratten mit Einstreu bei 22 °C nach einem umgekehrten 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zeitplan untergebracht (das Licht wird täglich von 21:00 bis 09:00 Uhr eingeschaltet).
   2. Bieten Sie während der gesamten Studie Zugang zu bestrahlten Lebensmitteln (siehe Materialtabelle) und Leitungswasser ad libitum .
2. Material- und chemische Vorbereitung
   1. Besorgen Sie sich alle erforderlichen Materialien und Chemikalien (wie in der Materialtabelle angegeben).
   2. Bewahren Sie THC in Forschungsqualität in Fläschchen auf, die 10 mg/ml oder 20 mg/ml THC enthalten, gelöst in Ethanol.
      HINWEIS: Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), da THC hautreizend und eine Aspirationsgefahr darstellt. Sichern Sie sich THC in einem Stahlschrank, da es vom US-Gesundheitsministerium und der US-amerikanischen Food and Drug Administration als kontrollierte Substanz der Liste I eingestuft wird.
3. Grundlegende Messungen
   1. Ermitteln Sie das Ausgangsgewicht für jede weibliche Ratte.
   2. Pausieren Sie das Experiment hier ggf. für 1-2 Wochen.
4. Zubereitung von THC-infundierten Keksen
   1. Bereiten Sie die Kekse 30 Minuten vor der Verabreichung täglich um 14:00 Uhr zu, um gleichbleibende Fütterungszeiten einzuhalten.
   2. Mini-Schokokekse trennen und etwa einen halben Teelöffel Erdnussbutter zur Creme geben.
   3. Mischen Sie die erforderliche Dosis THC (1,5 mg/kg für die ersten 2 Tage, gefolgt von 3 mg/kg für 7 Tage) mit der Erdnussbutter, bevor Sie den Keks zusammensetzen.
5. Auswertung des Verbrauchs
   1. Geben Sie einen einfachen Erdnussbutter-/Mini-Schokoladenkeks für 2-4 Tage, bis ein gleichmäßiger Verzehr erreicht ist. Nehmen Sie das Wasser aus dem Käfig und verabreichen Sie das Leckerli täglich um 14:00 Uhr mit einer Zange an jede Ratte.
   2. Beobachten, bis das Leckerli vollständig aufgebraucht ist. Entfernen Sie bei Bedarf Reste.
      HINWEIS: Verabreichen Sie THC in einer Dosis von 1,5 mg/kg für 2 Tage, gefolgt von 3 mg/kg für 7 Tage. Lassen Sie die Leckerlis bis zu 2 Stunden im Käfig für Ratten, die nicht sofort fressen.
   3. Fahren Sie nur mit Ratten fort, die einen konstanten Verzehr von Leckerlis zeigen. Entfernen Sie diejenigen mit inkonsistenter Erfassung aus dem Experiment.
   4. Bewerten Sie den Verbrauch vor der Schwangerschaft für 2 Wochen.
6. Gruppenzuordnung nach PCE
   1. Ordnen Sie Ratten mit konsistenter Aufnahme nach dem Zufallsprinzip entweder der einfachen (Kontrolle) oder der THC-infundierten (PCE) Keksgruppe zu.
   2. Erlauben Sie mindestens 4 Tage ohne Kekse vor der Zucht, um sicherzustellen, dass der THC-Ton aus dem System entfernt wird.

2. Cannabinoid-Exposition in der Schwangerschaft (pränatal)

1. Zucht und Trächtigkeitsbestätigung
   1. Wiegen Sie die Weibchen, um ein Startgewicht zu erhalten, bevor Sie sie in einen Käfig mit einem bewährten männlichen Züchter setzen (männlich ist THC-naiv).
   2. Achten Sie darauf, dass die weiblichen Ratten in dieser Zeit keinen Keks fressen.
   3. Bestätigen Sie die Schwangerschaft durch das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens, der normalerweise 24 Stunden nach der Paarung auftritt.
   4. Wiegen Sie die weibliche Ratte und setzen Sie sie in den Heimkäfig zurück. Dies ist definiert als Schwangerschaftstag (GD) 1.
2. THC-Infusion während der Schwangerschaft
   1. Geben Sie für die Dauer der Schwangerschaft täglich um 14:00 Uhr einen einfachen oder mit THC angereicherten Keks (3 mg/kg) ab GD 1.
   2. Fahre mit diesem Regime fort, bis festgestellt wird, dass das Muttertier für die Entbindung nistet, dann wird die THC-Exposition gestoppt.
3. Überwachung der Gewichtszunahme der Mutter
   1. Wiegen Sie die Rattenmütter zweimal pro Woche, um die Gewichtszunahme der Mutter zu beurteilen.
      HINWEIS: Die neuen Gewichte werden auch verwendet, um zu berechnen, wie viel THC in den Keks aufgenommen werden soll, wobei die Dosis je nach Gewicht des Muttertiers nach Bedarf angepasst wird.
4. Beendigung der THC-Exposition und Geburtsdokumentation
   1. Stoppen Sie die THC-Expositionsverfahren, wenn der Damm um den erwarteten Zeitpunkt der Abgabe herum nistet.
   2. Sobald die Nachkommen geboren sind, notieren Sie die Anzahl der lebenden Jungen.
   3. Bezeichnen Sie den Tag der Geburt als postnatalen Tag (P) 0.
5. Entwöhnung und Haltung der Nachkommen
   1. Entwöhnen Sie die Nachkommen am postnatalen Tag (P) 23.
   2. Gruppenbeherbergung des entwöhnten Nachwuchses mit Wurfgeschwistern je nach Geschlecht.
6. Euthanasie von Staudämmen
   1. Sobald der Wurf entwöhnt ist, werden die Muttertiere nach institutionell anerkannten Protokollen eingeschläfert.

3. Schritte nach dem Verfahren

1. Nachwuchshaltung und -überwachung
   1. Stellen Sie sicher, dass alle Nachkommen unter angemessenen Haltungsbedingungen gehalten werden, um die richtige Temperatur, das richtige Licht und die richtige Belüftung zu gewährleisten.
   2. Überwachen Sie die Welpen regelmäßig auf Gesundheits- oder Entwicklungsprobleme wie abnormales Körpergewicht oder Entwicklungsverzögerungen.
2. Bewertung der Ausgangslage
   1. Falls erforderlich, beurteilen Sie Ausgangswerte wie Körpergewicht, Reflexe oder andere relevante Entwicklungsparameter, bevor Sie Experimente an den Nachkommen beginnen.
3. Zuweisung von Experimentalgruppen
   1. Weisen Sie die Welpen nach dem Zufallsprinzip Versuchsgruppen zu, um Verzerrungen beim Testen zu minimieren.
   2. Begrenzen Sie die Anzahl der pro Versuch verwendeten Jungtiere auf 1-2 Jungtiere aus jedem Wurf, um mögliche Auswirkungen auf den Wurf zu reduzieren.

Ergebnisse

Um den freiwilligen Konsum von THC zu etablieren, wurden zahlreiche Leckereien getestet, um festzustellen, welche für die Ratten schmackhaft waren und schnell und konsequent konsumiert werden würden.

Zunächst wurden zuckerfreie Gelatinewürfel mit Erdbeergeschmack (1 Kubikml Größe), sowohl mit als auch ohne THC, getestet. Die Menge des Erdbeersirup-Aromas wurde erhöht und THC wurde in drei verschiedenen Konzentrationen (2 mg/kg/Dosis, 3 mg/kg/Dosis und 5...

Diskussion

Das hier skizzierte PCE-Paradigma beinhaltet den freiwilligen THC-Konsum durch trächtige Rattenmütter. Dies ist die erste Studie, die die THC-Verabreichung an trächtige Rattenmütter durch freiwillige Einnahme in einem präklinischen Modell untersucht. Beide Gruppen von Rattenmüttern nahmen die gleiche Rattenfutternahrung zu sich, wodurch die potenzielle Variabilität in der Ernährung und Kalorienaufnahme zwischen den Gruppen minimiert wurde. Tiermodelle bieten den Vorteil, dass der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5L0D PicoLab Laboratory Rodent Diet, irradiated	Purina LabDiet	5L0D
Cellulose/paper bedding BioFresh Comfort Bedding	BioFresh Vet	NA	https://biofreshvet.com/products/
Digital Kitchen Scale	Etekcity	EK4150
Female rats, 125-150 g	Inotiv	14005F
Long-Evans rats (Blue Spruce, HsdBlu: LE)	Inotiv	14016M
N10 Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	N10PLF
N10 Rodent Wire Lids	Ancare	N10SS
Narrow Pattern Forceps	Fine Science tools (FST)	11002-14
OREO mini chocolate Sandwich cookies, Go Paks, 12-3.5 oz cups	Amazon	B0198TUO7W
proven adult breeder males	Inotiv	14016M
Rat static polysulfone microisolator cages (R20):
Research Grade THC  (only available with a DEA license, Schedule I drug)	NIDA	NA	https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program
SKIPPY Creamy Peanut Butter spread	Amazon	B0C75KZ28C
THC Consumption Supplies: