Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Resumen

En este video, te mostramos cómo los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre embrionarias humanas pueden ser analizadas utilizando en ensayos de actividad gel.

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos citoplásmicos que tienen un papel primordial en el metabolismo celular y la homeostasis, la regulación de la red de señalización celular y muerte celular programada. Las mitocondrias producen ATP, regulan el estado redox citoplasmático y Ca2 + equilibrio, catabolizar ácidos grasos, síntesis del grupo hemo, nucleótidos, hormonas esteroides, aminoácidos, y ayudar a armar hierro-azufre en las proteínas. Las mitocondrias también tienen un papel esencial en la producción de calor. Las mutaciones del genoma mitocondrial causar varios tipos de trastornos humanos. La acumulación de mutaciones en el ADNmt se correlaciona con la edad y se sospecha que tienen un papel importante en el desarrollo del cáncer. Debido a su papel de vital importancia en todos los tipos de células, la función de las mitocondrias también se debe ser crítico para las células madre. Principales avances se han hecho en nuestra comprensión de la viabilidad de las células madre, proliferación y capacidad de diferenciación. Sin embargo, la actividad funcional de las células madre, en su condición particular de la energía, no se ha estudiado en detalle. Casi nada se sabe acerca de las propiedades de las mitocondrias de células madre embrionarias humanas (hESCs) y su progenie diferenciada precursor. Una manera de entender y evaluar el papel de la mitocondria en células madre y la función potencial de desarrollo es medir directamente la actividad de los complejos respiratorios mitocondriales. A continuación, describimos alta resolución clara electroforesis en gel nativo y la posterior visualización en gel de la actividad como un método para el análisis de los cinco complejos de la cadena respiratoria de hESCs.

Protocolo

Alta resolución clara Electroforesis en gel nativo (hrCNE) para el Complejo mitocondrial en gel ensayos de actividad

Células madre embrionarias humanas (hESCs) se mantuvieron en una monocapa de fibroblastos de ratón irradiados ˠ o mitomicina C tratados con embrionarias (MEFs), luego pasó a un crecimiento en Matrigel durante 5 días en el MEF-medio condicionado con las condiciones estándar. Para eliminar la contaminación MEFs, hESCs fueron re-chapada en Matrigel y cultivadas en MEF medio condicionado por otros 3 días. Microscopio de inmunofluorescencia para los marcadores de pluripotencia Oct-4 y SSEA 4 se utilizó para confirmar la falta de diferenciación de células madre.

1. Lavar las células con PBS caliente 1x, pH 7,4, seguido de tripsinización (1 ml de tripsina 1x por pocillo en una placa de 6 pocillos) durante 5 min.
2. Añadir un volumen igual de fresca inhibidor de tripsina (1mg/ml en 1x PBS, pH 7,4). Las células de la cosecha y se centrifuga a 200 g, 5 min, a temperatura ambiente.
3. Deseche las células pellets sobrenadante y resuspender en 0,8 - 1.7ml (basado en el tamaño de la celda de pellets) de hielo frío aislamiento de amortiguación mitocondrias (83 mm de sacarosa; 6.6mm imidazol / HCl, pH 7,0) con un recién preparada "cóctel inhibidor de la proteasa. Incubar en hielo durante 10 min.
4. Dounce células con un homogeneizador (~ 40 - 50 golpes). Tinción de una parte alícuota de las células dounced con azul tripán para comprobar la integridad de la homogeneización utilizando un microscopio de luz.
5. Centrifugar a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C para obtener un crudo pellet mitocondrial que también contiene núcleos y fragmentos más grandes de la célula. Se decanta y se desecha el sobrenadante y pesar el precipitado crudo mitocondrial de pellets. Los gránulos pueden ser almacenadas a -80 ° C tras la congelación instantánea en nitrógeno líquido, si esto es un punto de parada.
   
   NOTA: centrifugación diferencial o de otros procedimientos basados ​​en gradiente puede ser utilizado para el aislamiento y la recolección de una fracción pura membrana mitocondrial. Ver ref. 4 para más detalles. Este enfoque alternativo producirá la actividad mitocondrial complejo por mg de proteína mitocondrial en lugar de compleja actividad por mg de peso celular o el número de células. La concentración de proteínas mitocondriales tendrá que ser determinada después de la purificación para hacer esta comparación. Además, un aislamiento de amortiguación diferentes pueden ser necesarios para este enfoque. Para la solubilización de la fracción de membrana mitocondrial puro, vea la nota siguiente paso 6.
   
   
6. Solubilizar el crudo pellet mitocondrial en el hielo por agitación con tampón de solubilización de hielo frío (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM de 6 aminohexanoico). Ácido 6-aminohexanoico puede ser sustituido por el cóctel inhibidor de la proteasa 1x. Use 35μl de tampón de solubilización por 20 mg de peso de pellets. Añadir 20μl de 10% w / v digitonina por 20 mg de peso pellet y mezclar agitando el tubo. Incubar durante 50-10 min en hielo. Dodecil-bD-maltoside o Triton X-100 puede ser sustituido por digitonina para solubilizar las proteínas. La elección del detergente y su cantidad puede afectar la formación de supercomplexes o formas multiméricas de los complejos mitocondriales. Para más información, consulte ref.1.
   
   NOTA: La cantidad de detergente para solubilizar una fracción pura membrana mitocondrial corresponde a una relación en peso de detergente / proteína que van desde 2-6 g / g. La relación óptima para solubilizar las membranas mitocondriales es 2,5 g / g de dodecil-bD-maltoside, 3 g / g de Triton X-100, y 6 g / g de digitonina.
   
   
7. Centrifugar el sedimento solubilizada a 100.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro.
8. Añadir tampón de carga a una definitiva del 5% w / v de glicerol y 0,01% w / v Ponceau S (utilice un 50% w / v de glicerol, 0,1% w / v buffer Ponceau S carga solución madre).
9. Pozos de carga de gel con un volumen que contiene 20-40mg del crudo pellet mitocondrial por carril. Use un gel con gradiente de acrilamida (4 -13%) con un 3,5% gel de apilamiento.
   
   Nota: La preparación del gel y las condiciones de electroforesis:
   
   Para la preparación de gel, use un acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mezcla de la siguiente manera: 48 gramos de acrilamida y 1,5 g de bisacrilamida (49,5% T, 3% C. Donde T es la concentración total de AA y bisAA y C es el porcentaje de entrecruzamiento (bisAA) a monómero total).
   
   Gel buffer (3 '): 1,5 millones 6 aminohexanoico; 75mm imidazol, pH 7,0

En gel de gradiente:	4%	13%	Gel de apilamiento:	3,5%
AA / 3 bisAA mezcla	2 ml	6,5 ml		0,6 ml
Gel de amortiguación 3 '	8,3 ml	8,3 ml		2,7 ml
Glicerol		5 g
H 2 O	14,7 ml	5 ml		4,7 ml
Volumen total	25 ml	25 ml		8 ml
10% de APS	139 l	125 l		67 l
TEMED	14 l	12,5 l		6,7 l

Ánodo de buffer: 25 mM imidazol / HCl, pH 7,0

Tampón catódico: Tricina 50 mM, 7,5 mm de imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltoside, 0.05% w / v desoxicolato, pH 7,0

Vierta y ejecutar los geles en un cuarto frío (4-7 ° C). La tensión inicial utilizada es de 100V. Cuando la muestra ha entrado en el gel de apilamiento, la tensión se eleva a 500 V con la corriente limitada a 15 mA (de 0.15 '14' 14 cm de gel). La electroforesis es detenido después de 3-4 horas cuando la línea divisoria de colorante rojo punzó el S se acerca a la parte delantera de gel. Por otra parte, un gel puede ser ejecutado durante la noche con una tensión constante en el 70-100V.

1. En gel de ensayos de actividad. El tiempo de incubación para cada ensayo depende de la eficiencia de solubilización de proteínas y la cantidad de material cargado por pozo. Complejos I, IV y V por lo general el rendimiento señales más fuertes que los complejos II y III.

Complejo I (CI)

Incubar la rebanada de gel con CI de amortiguación (5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente durante varias horas.

IC del búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4:

0,01 g NADH

0,25 g de NBT

Fijar el gel en el 50% de metanol y ácido acético 10% para 15-45 min. El gel se mantiene fija en 10% de ácido acético.

El complejo II (CII)

Incubar la rebanada de gel con la CII buffer (20 mM succinato de sodio; methasulfate fenazina 0.2mm; 2.5mg/ml NBT, 5 mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente durante varias horas.

CII búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4:

200μl succinato sódico 1M

80μl methasulfate fenazina (PMS 250 mm disuelto en DMSO)

0,25 g de NBT

Fijar el gel como se describe para el Complejo I

El complejo III (CIII)

Incubar la rebanada de gel con CIII buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente durante varias horas.

CIII búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2:

50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina

Fijar el gel como se describe para el Complejo I

Complejo IV (CIV)

Incubar la rebanada de gel con CIV buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB), 50 micras caballo corazón citocromo c) a temperatura ambiente durante varias horas.

CIV búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2:

50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina

0,1 g de caballos corazón del citocromo c

Fijar el gel como se describe para el Complejo I

Complejo V (CV)

Incubar la rebanada de gel con tampón CV (35 mm Tris-base, 270 mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14 mm de MgSO _4, 0,2% w / v Pb (NO _{3) 2,} 8 mm ATP) a temperatura ambiente durante varias horas.

CV búfer: 100 ml por la solución de añadir:

Tris-base	0.424g
Glicina	2.026g
MgSO4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

No hay necesidad de ajustar el pH (debe ser 8.3) - no utilizar ácido o base. Filtrar y añadir

ATP

0.441g

Fijar el gel en el 50% de metanol durante 30 minutos y la transferencia de agua.

Discusión

En este vídeo, que hemos descrito la extracción de complejos de proteínas mitocondriales de células madre embrionarias humanas, la separación de alta resolución clara electroforesis en gel nativo (hrCNE), y el posterior análisis en gel de ensayos de actividad catalítica. hrCNE resuelve complejos proteína de la membrana mitocondrial con una resolución comparable a la de la electroforesis en gel nativo azul y es superior para los ensayos de actividad en gel. Esta técnica se puede emplear no sólo para cuantificar respiratoria mitoc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M Sodium succinate	Fisher Scientific	S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2	Fisher Scientific	BP332-1 and BP329-1	Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)	EMD Millipore	9010	store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0	Sigma-Aldrich	I-2399	store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)	Fluka	37008-1G	Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid	Fluka	07260-100G	store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution	Sigma-Aldrich	P-3504 and G6279-1L	0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate	Fluka	30970-25G	Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)	TCI America	P0083	Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c From horse heart	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
100x protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at – 20 C.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypan blue Stain 0.4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0.5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Trypsin Inhibitor	GIBCO, by Life Technologies	17075-029