Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Резюме

В этом видео мы покажем вам, как дыхательной цепи митохондрий комплексы человеческие эмбриональные стволовые клетки могут быть проанализированы с помощью геля в анализах деятельности.

Аннотация

Митохондрии являются цитоплазматические органеллы, которые имеют первостепенную роль в клеточном метаболизме и гомеостаза, регуляции клеточных сигналов сети, и запрограммированной смерти клетки. Митохондрии производить АТФ, регулирует окислительно-восстановительное состояние цитоплазматических и Ca2 + баланс, катаболизировать жирных кислот, синтез гема, нуклеотиды, стероидные гормоны, аминокислоты, а также помочь собрать железо-серные кластеры в белках. Митохондрии также имеют существенную роль в выработке тепла. Мутации митохондриального генома причиной нескольких видов человеческой расстройства. Накопление мутаций мтДНК коррелирует с возрастом и подозревается в важную роль в развитии рака. Из-за их жизненно важную роль во всех типах клеток, функции митохондрий, должны также иметь решающее значение для стволовых клеток. Основные успехи были достигнуты в нашем понимании жизнеспособности стволовых клеток, пролиферацию и дифференциацию мощности. Но функциональную активность стволовых клеток, в частности, статуса свою энергию, еще не был детально изучен. Почти ничего не известно о митохондриальной свойства человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и их дифференцированного потомства предшественника. Один из способов понять и оценить роль митохондрий в функции чЭСК и развития потенциала для непосредственного измерения активности митохондриальных дыхательных комплексов. Здесь мы описываем высоким разрешением ясно родной гель-электрофореза и последующей деятельности в геле визуализации как метод анализа пять комплексов дыхательной цепи ЭСК.

протокол

Высокое разрешение Открытый Родные Electophoresis гель (hrCNE) для митохондриальной комплекс В-гель Анализы активность

Человека эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) были сохранены на монослой ˠ-облученных или митомицин С обработанных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), затем перешел на рост на Матригель течение 5 дней в МЭФ-кондиционированной среды с использованием стандартных условиях. Для удаления загрязняющих MEFs, ЭСК были повторно высевают на Матригель и выросли в МЭФ-кондиционированной среды для дополнительных 3 дня. Иммунофлуоресценции микроскопии для маркеров плюрипотентности Oct-4 и SSEA-4 была использована для подтверждения отсутствия чЭСК дифференциации.

1. Вымойте клеток с теплой 1x PBS, рН 7,4, после чего трипсинизации (1 мл 1 раз трипсина на лунку в 6-луночный планшет) в течение 5 мин.
2. Добавить равный объем свежей ингибитора трипсина (1mg/ml в 1x PBS, рН 7,4). Урожай клеток и центрифуге при 200 г, 5 мин, при комнатной температуре.
3. Удалите супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 0,8 - 1.7ml (исходя из размера осадок клеток) ледяной митохондрий буфера изоляция (83 мм сахароза; 6,6 мм имидазола / HCl, рН 7,0) с свежеприготовленный коктейль ингибиторов протеаз 1 '. Инкубировать на льду в течение 10 мин.
4. Dounce клеток с гомогенизатор (~ 40 - 50 ударов). Пятно аликвоту dounced клеток с трипанового синего для проверки полноты гомогенизации использованием светового микроскопа.
5. Центрифуга на 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С до получения сырого митохондриальной гранул, которая также содержит ядер и более крупные фрагменты клетки. Декантировать и отбросить супернатант и весят осажденный сырой митохондриальные гранулы. Гранулы могут храниться при температуре -80 ° C следующий момент замораживания в жидком азоте, если это точки остановки.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: центрифугирования Дифференциальная или другой градиент основе процедур может быть использован для выделения и сбора чистой фракции митохондрий мембраны. См. ссылку. 4 для деталей. Этот альтернативный подход даст митохондриальной сложной деятельности на мг белка митохондрий вместо сложной деятельности на мг веса ячейки или числом. Концентрация митохондриальных белков необходимо будет определена после очистки, чтобы сделать такое сравнение. Кроме того, различные буфера изоляции могут потребоваться для этого подхода. Для солюбилизации чистой фракции митохондрий мембраны, см. примечание следующий шаг 6 ниже.
   
   
6. Растворения сырой митохондриальной гранул на льду вортексе с ледяной буфера солюбилизации (50 мМ NaCl, 50 мМ имидазола / HCl рН 7,0, 1 мМ EDTA, 2 мМ 6-aminohexanoic кислоты). 6-aminohexanoic кислота может быть заменена 1x коктейль ингибиторов протеазы. Используйте 35μl солюбилизации буфер на 20 мг веса гранул. Добавить 20 мкл 10% вес / дигитонин в 20 мг гранул веса и смешать, щелкая трубки. Инкубируйте в течение 5-10 мин на льду. Додецилсульфата-BD-maltoside или тритона Х-100 может быть заменен на дигитонин для растворения белков. Выбор моющего средства и его количество может влиять на формирование supercomplexes или мультимерные формы митохондриальных комплексов. Для получения дополнительной информации см. задания 1.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: количество моющего средства, необходимые для растворения чистого митохондриальной фракции мембран соответствует моющего средства / белок веса в пределах от 2-6 г / г. Оптимальное соотношение для растворения митохондриальных мембран 2,5 г / г для додецилсульфата-BD-maltoside, 3 г / г для тритона Х-100, и 6 г / г для дигитонин.
   
   
7. Центрифуга солюбилизированного гранул на 100 000 г в течение 15 мин при 4 ° C. Сбор ясно супернатант.
8. Добавить загрузки буфера для окончательного 5% вес / объем глицерина и 0,01% вес / пунцовый S (использование 50% вес / объем глицерина, 0,1% м / о загрузке пунцовый S буферный запас раствора).
9. Нагрузка гель скважин с объемом, который содержит 20-40мг сырой митохондриальные гранулы на одну полосу движения. Используйте гель акриламида градиент (4 -13%) с 3,5% укладки гелем.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка гель-электрофореза и условия:
   
   Для геля, использовать акриламид / бис-акриламида (АА / bisAA) 3 смесь следующим образом: 48 г акриламида и 1,5 г bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Если Т является общей концентрации АА и bisAA и С Процент сшивателя (bisAA) в общих мономера).
   
   Гель буфера (3 '): 1,5 6-aminohexanoic кислоты; 75 мм имидазола, рН 7,0

Градиент геля:	4%	13%	Укладка геля:	3,5%
AA / bisAA 3 смеси	2 мл	6,5 мл		0,6 мл
Гель буфера 3 '	8,3 мл	8,3 мл		2,7 мл
Глицерин		5 г
H 2 O	14,7 мл	5 мл		4,7 мл
Общий объем	25 мл	25 мл		8 мл
10% APS	139 мкл	125 мкл		67 мкл
TEMED	14 мкл	12,5 мкл		6,7 мкл

Анодный буфер: 25 мМ имидазола / HCl, рН 7,0

Катод буфера: 50 мМ Tricine, 7,5 мм имидазола / HCl, 0,02% вес / додецил-BD-maltoside, 0,05% вес / дезоксихолата, рН 7,0

Залейте и запустите гелей в холодном помещении (4-7 ° С). Начальное напряжение 100В используется. Когда образец вступил концентрирующий гель, повышении напряжения до 500В с ограничением тока до 15 мА (по 0,15 '14' 14 см, гели). Электрофорез прекращается через 3-4 ч при резком линии красителя красный пунцовый S подходит гель фронт. Кроме того, гель можно работать на ночь с постоянным напряжением в 70-100В.

1. В-гель анализов деятельности. Время инкубации для каждого анализа зависит от эффективности белка солюбилизации и количество материала загружены на лунку. Комплексы I, IV и V обычно дают более сильные сигналы, чем комплексов II и III.

Комплекс I (CI)

Инкубируйте геля с CI буфер (5 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml НБТ) при комнатной температуре в течение нескольких часов.

CI буфер: Добавить на 100 мл 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4:

0,01 г NADH

0,25 НБТ

Fix гель в 50% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 15-45 мин. Фиксированной гель сохраняется в 10% уксусной кислоты.

Комплекс II (CII)

Инкубируйте геля с CII буфер (20 мМ сукцината натрия; 0,2 methasulfate феназина; 2.5mg/ml НБТ; 5 мМ Трис-HCl рН 7,4) при комнатной температуре в течение нескольких часов.

CII буфер: Добавить на 100 мл 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4:

200 мкл 1М сукцинат натрия

80μl феназина methasulfate (250 мм PMS растворяется в ДМСО)

0,25 НБТ

Fix гель, как описано для Комплекс I

Комплекс III (CIII)

Инкубируйте геля с CIII буфер (50 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 0,05% 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB)) при комнатной температуре в течение нескольких часов.

CIII буфер: Добавить 100 мл 50 мМ натрий-фосфат, рН 7,2:

50 мг диаминобензидина tetrahydrochloride

Fix гель, как описано для Комплекс I

Комплекс IV (CIV)

Инкубируйте геля с ЦИВ буфер (50 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 0,05% 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB), 50 мкм лошади сердце цитохром с) при комнатной температуре в течение нескольких часов.

CIV буфер: Добавить 100 мл 50 мМ натрий-фосфат, рН 7,2:

50 мг диаминобензидина tetrahydrochloride

0,1 г лошадь сердце цитохром с

Fix гель, как описано для Комплекс I

Комплекс V (CV)

Инкубируйте геля с CV буфера (35 мм Трис-основание, 270мм глицин, рН 8,3 при 25 ° С, 14мм MgSO _4, 0,2% мас. / Pb (NO _{3) 2,} 8 мм АТФ) при комнатной температуре в течение нескольких часов.

CV буфера: на 100 мл раствора добавить:

Трис-основание	0.424g
Глицин	2.026g
MgSO 4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

Нет необходимости корректировки рН (должно быть 8,3) - не использовать кислоты или основания. Фильтр и добавить

ATP

0.441g

Fix гель в 50% метанола в течение 30 мин и трансфер в воде.

Обсуждение

В этом видео, мы описали добычи митохондриальной белковых комплексов из человеческих эмбриональных стволовых клеток, их разделение на высокое разрешение ясно родной гель-электрофореза (hrCNE), а также последующий анализ на в-гель каталитического анализов деятельности. hrCNE решает митохондриальных ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M Sodium succinate	Fisher Scientific	S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2	Fisher Scientific	BP332-1 and BP329-1	Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)	EMD Millipore	9010	store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0	Sigma-Aldrich	I-2399	store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)	Fluka	37008-1G	Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid	Fluka	07260-100G	store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution	Sigma-Aldrich	P-3504 and G6279-1L	0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate	Fluka	30970-25G	Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)	TCI America	P0083	Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c From horse heart	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
100x protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at – 20 C.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypan blue Stain 0.4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0.5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Trypsin Inhibitor	GIBCO, by Life Technologies	17075-029