Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Riepilogo

In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.

Abstract

I mitocondri sono organelli citoplasmatici che hanno un ruolo primario nel metabolismo cellulare e l'omeostasi, la regolamentazione della rete di segnalazione cellulare, e la morte cellulare programmata. I mitocondri producono ATP, regolare lo stato redox citoplasmatico e Ca2 + equilibrio, catabolizzare acidi grassi, sintesi dell'eme, nucleotidi, ormoni steroidi, amminoacidi, e aiutare assemblare ferro-zolfo in proteine. I mitocondri hanno anche un ruolo essenziale nella produzione di calore. Le mutazioni del genoma mitocondriale causa diversi tipi di disturbo umano. L'accumulo di mutazioni del mtDNA è correlata con l'invecchiamento e si sospetta di avere un ruolo importante nello sviluppo del cancro. Grazie al loro ruolo di vitale importanza in tutti i tipi di cellule, la funzione dei mitocondri devono anche essere critico per le cellule staminali. Progressi fondamentali sono stati fatti nella comprensione della vitalità delle cellule staminali, proliferazione, e la capacità di differenziazione. Ma l'attività funzionale delle cellule staminali, in particolare il loro stato di energia, non era ancora stato studiato in dettaglio. Quasi nulla si sa circa le proprietà mitocondriale di cellule staminali embrionali umane (hESC) e la loro progenie precursore differenziata. Un modo per comprendere e valutare il ruolo dei mitocondri nella funzione hESC e potenziale di sviluppo è quello di misurare direttamente l'attività dei complessi respiratori mitocondriali. Qui, descriviamo alta elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa e la successiva visualizzazione in attività di gel come un metodo per analizzare i cinque complessi della catena respiratoria di hESC.

Protocollo

Alta Electophoresis risoluzione nativa gel trasparente (hrCNE) per complessi mitocondriale In-Gel Attività saggi

Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono stati mantenuti su un monostrato di ˠ-irradiati o mitomicina C trattati con fibroblasti embrionali di topo (MEF), poi passati a una crescita su Matrigel per 5 giorni in MEF condizionata media con condizioni standard. Per rimuovere i contaminanti MEF, hESC sono stati ri-placcato su Matrigel e cresciuto in MEF condizionata medio per altri 3 giorni. Microscopia di immunofluorescenza per i marcatori pluripotenza Oct-4 e SSE-4 è stato utilizzato per confermare la mancanza di differenziazione hESC.

1. Lavare le cellule con caldo 1x PBS, pH 7,4, seguita da tripsinizzazione (1x 1 ml di tripsina per bene in un 6-pozzetti) per 5 min.
2. Aggiungere un uguale volume di fresca inibitore della tripsina (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Celle di raccolta e centrifugare a 200g, 5 min, temperatura ambiente.
3. Eliminare le cellule surnatante e risospendere pellet in 0,8 - 1.7ml (in base alle dimensioni del pellet) di tampone di ghiaccio freddo isolamento dei mitocondri (83mm saccarosio; 6,6 mm imidazolo / HCl, pH 7,0) con appena preparato 1 'Cocktail di inibitori della proteasi. Incubare in ghiaccio per 10 minuti.
4. Dounce cellule con un omogeneizzatore (~ 40 - 50 colpi). Macchia una aliquota di cellule dounced con trypan blu per verificare la completezza di omogeneizzazione utilizzando un microscopio ottico.
5. Centrifugare a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C per ottenere un grezzo mitocondriale pellet che contiene anche i nuclei e frammenti di cellule più grandi. Decantare e scartare il surnatante e pesare il greggio precipitato a pellet mitocondriale. Il pellet può essere conservato a -80 ° C a seguito immediato congelamento in azoto liquido, se questo è un punto di arresto.
   
   NOTA: centrifugazione differenziale o altri gradiente basato su procedure possono essere utilizzate per l'isolamento e la raccolta di una frazione pura membrana mitocondriale. Vedi rif. 4 per i dettagli. Questo approccio alternativo produrrà l'attività mitocondriale complesso per mg di proteina mitocondriale invece di complessa attività per mg di peso cellulare o numero di cellulare. La concentrazione di proteine ​​mitocondriali dovrà essere determinato dopo la purificazione per fare questo confronto. Inoltre, un buffer di isolamento diversi possono essere richiesti per questo approccio. Per la solubilizzazione della frazione pura membrana mitocondriale, vedere la nota seguente punto 6.
   
   
6. Solubilizzare il greggio mitocondriale pellet su ghiaccio con il vortex con il tampone di solubilizzazione ghiaccio freddo (50 mM NaCl, 50 mM imidazolo / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic acido). L'acido 6-aminohexanoic può essere sostituito con il Cocktail 1x inibitore della proteasi. L'uso 35μl di tampone solubilizzazione per 20 mg di peso a pellet. Aggiungere 20μl del 10% w / v digitonina per 20 mg di peso a pellet e mescolare muovendo il tubo. Incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio. Dodecil-BD-maltoside o Triton X-100 può essere sostituito per digitonina per solubilizzare le proteine. La scelta del detersivo e la sua quantità può influenzare la formazione di supercomplexes o forme multimerica di complessi mitocondriali. Per ulteriori informazioni, vedere rif.1.
   
   NOTA: La quantità di detersivo necessaria per solubilizzare una frazione pura membrana mitocondriale corrisponde ad un detergente / proteine ​​di peso che varia dai 2-6g / g. Il rapporto ottimale per solubilizzare le membrane mitocondriali è 2.5g / g per dodecil-BD-maltoside, 3g / g per Triton X-100, e 6 g / g per digitonina.
   
   
7. Centrifugare il pellet solubilizzato a 100.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante.
8. Aggiungi il caricamento del buffer ad una finale del 5% w / v glicerolo e 0,01% w / v Ponceau S (uso un 50% w / v glicerolo, 0,1% w / v tampone Ponceau S soluzione di carico magazzino).
9. Carico pozzi gel con un volume che contiene i 20-40mg del greggio mitocondriale pellet per corsia. Utilizzare un gel gradiente di acrilammide (4 -13%) con un 3,5% stacking gel.
   
   NOTA: preparazione gel elettroforesi e condizioni:
   
   Per la preparazione di gel, utilizzare un acrilamide / bis-acrilamide (AA / bisAA) 3 miscela come segue: 48 g di acrilamide e 1,5 g di bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Se T è la concentrazione totale di AA e bisAA e C è la percentuale di reticolante (bisAA) per monomero totale).
   
   Gel tampone (3 '): 1,5 M 6-aminohexanoic acido; 75mm imidazolo, pH 7,0

Gradiente di gel:	4%	13%	Stacking gel:	3,5%
AA / bisAA 3 mix	2 ml	6,5 ml		0,6 ml
Gel tampone 3 '	8,3 ml	8,3 ml		2,7 ml
Glicerina		5 g
H 2 O	14,7 ml	5 ml		4,7 ml
Volume totale	25 ml	25 ml		8 ml
10% di APS	139 microlitri	125 microlitri		67 microlitri
TEMED	14 microlitri	12,5 microlitri		6,7 microlitri

Anodo buffer: 25mM imidazolo / HCl, pH 7,0

Catodo buffer: Tricine 50mm, 7.5mm imidazolo / HCl, 0,02% w / v dodecil-BD-maltoside, 0,05% w / v desossicolato, pH 7,0

Versare ed eseguire gel in una stanza fredda (4-7 ° C). La tensione iniziale utilizzato è 100V. Quando il campione è entrato nel gel impilati, la tensione è aumentata a 500V con la corrente limitata a 15mA (per 0,15 '14' 14 cm di gel). Elettroforesi viene arrestata dopo 3-4 ore quando la linea netta di colorante rosso del Ponceau S si avvicina alla parte anteriore gel. In alternativa, un gel può essere eseguito durante la notte con tensione costante a 70-100V.

1. In-gel attività saggi. Il tempo di incubazione per ogni test dipende dall'efficienza di solubilizzazione delle proteine ​​e la quantità di materiale caricato per bene. Complessi I, IV e V di solito resa più forti segnali di complessi II e III.

Complesso I (CI)

Incubare la fetta gel con CI tampone (5mm Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente per diverse ore.

IC buffer: Aggiungere per 100 ml di 5mM Tris-HCl, pH 7,4:

0.01g NADH

0,25 g NBT

Fissare il gel in metanolo al 50% e 10% di acido acetico per 15-45 min. Il gel fisso è conservata nel 10% di acido acetico.

Complesso II (CII)

Incubare la fetta gel con CII buffer (20 mM di sodio succinato; methasulfate phenazine 0,2 mm; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente per diverse ore.

CII buffer: Aggiungi 5mM per 100 ml di Tris-HCl, pH 7,4:

200μl succinato di sodio 1M

80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm sciolto in DMSO)

0,25 g NBT

Fissare il gel come descritto per il complesso I

Complesso III (CIII)

Incubare la fetta gel con CIII tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente per diverse ore.

CIII buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2:

50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro

Fissare il gel come descritto per il complesso I

Complesso IV (CIV)

Incubare la fetta gel con CIV tampone (fosfato di sodio 50mM, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB), 50 micron cavallo cuore citocromo c) a temperatura ambiente per diverse ore.

CIV buffer: Aggiungere per 100 ml di 50 mM di sodio-fosfato, pH 7,2:

50mg diaminobenzidina tetraidrocloruro

0.1g cavallo cuore citocromo c

Fissare il gel come descritto per il complesso I

Complesso V (CV)

Incubare la fetta gel con CV buffer (Tris-base da 35 mm, 270 mm glicina, pH 8.3 a 25 ° C, 14 mm MgSO _4, 0,2% w / v Pb (NO _{3) 2,} 8 mm ATP) a temperatura ambiente per diverse ore.

CV buffer: 100 ml di soluzione Per aggiungere:

Tris-base	0.424g
Glicina	2.026g
MgSO 4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

Non è necessario aggiustare il pH (dovrebbe essere 8.3) - non usare l'acido o di base. Filtrare e aggiungere

ATP

0.441g

Fissare il gel in metanolo al 50% per 30 min e trasferimento in acqua.

Discussione

In questo video, che abbiamo descritto l'estrazione di complessi proteici mitocondriali di cellule staminali embrionali umane, la loro separazione da alte elettroforesi su gel chiaro risoluzione nativa (hrCNE), e la successiva analisi di in-gel saggi di attività catalitica. hrCNE risolve complessi proteici della membrana mitocondriale con una risoluzione paragonabile a quella di blu elettroforesi su gel nativi ed è superiore per in-gel prove di attività. Questa tecnica può essere utilizzato non solo per quantificare respiratoria mit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M Sodium succinate	Fisher Scientific	S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2	Fisher Scientific	BP332-1 and BP329-1	Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)	EMD Millipore	9010	store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0	Sigma-Aldrich	I-2399	store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)	Fluka	37008-1G	Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid	Fluka	07260-100G	store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution	Sigma-Aldrich	P-3504 and G6279-1L	0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate	Fluka	30970-25G	Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)	TCI America	P0083	Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c From horse heart	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
100x protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at – 20 C.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypan blue Stain 0.4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0.5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Trypsin Inhibitor	GIBCO, by Life Technologies	17075-029