Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Resumo

Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

Resumo

As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas que têm um papel fundamental no metabolismo celular ea homeostase, a regulação da rede de sinalização celular e morte celular programada. Mitocôndrias produzem ATP, regular o estado redox citoplasmático e Ca2 + equilíbrio, catabolizar ácidos gordos, sintetizar heme, nucleotídeos, hormônios esteróides, aminoácidos, e ajudar a montar ferro-enxofre em proteínas. Mitocôndria também têm um papel essencial na produção de calor. Mutações do genoma mitocondrial causar vários tipos de desordem humana. O acúmulo de mutações do mtDNA correlaciona-se com o envelhecimento e é suspeito de ter um papel importante no desenvolvimento do câncer. Devido ao seu papel de vital importância em todos os tipos de células, a função das mitocôndrias também deve ser crítico para as células-tronco. Avanços importantes foram feitos em nossa compreensão da viabilidade de células-tronco, proliferação e capacidade de diferenciação. Mas a atividade funcional das células-tronco, no estado de energia particular, a sua, não foi ainda estudado em detalhe. Quase nada se sabe sobre as propriedades mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e seus descendentes precursor diferenciadas. Uma maneira de compreender e avaliar o papel da mitocôndria na função CTEh e potencial de desenvolvimento é o de medir diretamente a atividade dos complexos respiratórios mitocondriais. Aqui, descrevemos de alta resolução de eletroforese em gel claro nativa e posterior visualização em gel atividade como um método para analisar os cinco complexos da cadeia respiratória de hESCs.

Protocolo

Alta Resolução Eletroforese Gel Limpar Native (hrCNE) para Complex mitocondrial em Gel-ensaios de atividade

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) foram mantidos em uma monocamada de ˠ irradiados ou mitomicina C fibroblastos tratados com embrionárias de camundongos (MEFs), depois passou para o crescimento em Matrigel por 5 dias em MEF-condicionado médio utilizando condições padrão. Para remover contaminantes MEFs, hESCs foram re-semeadas em Matrigel e cultivadas em MEF-condicionado meio de um adicional de 3 dias. Microscopia de imunofluorescência para marcadores de pluripotência Oct-4 e SSEA-4 foi usado para confirmar a falta de diferenciação CTEh.

1. Lavar as células com PBS 1x quente, pH 7,4, seguido por tripsinização (1 ml de tripsina 1x por bem em uma placa de 6 poços) por 5 min.
2. Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina frescos (1mg/ml em 1x PBS, pH 7,4). Células colheita e centrifugar a 200 g, 5 min, temperatura ambiente.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 0,8 peletizada - 1.7ml (baseado no tamanho do pellet celular) de gelo tampão de isolamento a frio mitocôndrias (83mm de sacarose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) preparada na hora com Cocktail Inibidor 1 'Protease. Incubar no gelo por 10 min.
4. Dounce células com um homogeneizador (~ 4-50 AVC). Mancha uma alíquota das células dounced com azul de tripano para verificar integridade de homogeneização utilizando um microscópio de luz.
5. Centrifugar a 20.000 g por 10 min a 4 ° C para obter um bruto mitocondrial pelota que também contém núcleos e fragmentos de célula maior. Decantar e desprezar o sobrenadante e pesar o precipitado bruto mitocondrial pellet. O pellet podem ser armazenadas a -80 ° C após congelamento em nitrogênio líquido instante se este é um ponto de parada.
   
   NOTA: centrifugação diferencial ou outros baseados em gradiente de procedimentos podem ser usados ​​para isolar e coletar uma fração de membrana pura mitocondrial. Ver ref. 4 para mais detalhes. Esta abordagem alternativa trará a atividade mitocondrial complexo por mg de proteína mitocondrial em vez de atividade complexa por mg de peso celular ou número de celular. A concentração de proteínas mitocondriais terá de ser determinada após a purificação para fazer esta comparação. Além disso, um buffer de isolamento diferentes podem ser necessários para esta abordagem. Para solubilização da fração de membrana pura mitocondrial, consulte a seguinte nota a etapa 6 abaixo.
   
   
6. Solubilizar o crude mitocondrial pellet no gelo por vórtex com gelo tampão de solubilização a frio (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic ácido). Ácido 6-aminohexanoic pode ser substituído com o Cocktail 1x Inibidor da Protease. Use 35μl de tampão de solubilização por 20mg de peso pelota. Adicionar 20μl de 10% w / v digitonina por 20mg de pellet de peso e misture sacudindo o tubo. Incubar por 50-10 min no gelo. Dodecil-bD-maltosídeo ou triton X-100 pode ser substituído por digitonina para solubilizar as proteínas. A escolha do detergente e sua quantidade pode afetar a formação de supercomplexes ou formas multimérica dos complexos mitocondriais. Para mais informações, consulte ref.1.
   
   NOTA: A quantidade de detergente necessária para solubilizar uma fração de membrana pura mitocondrial corresponde a uma relação peso / detergente de proteínas variando de 2-6g / g. A proporção ideal para solubilizar as membranas mitocondrial é 2,5 g / g de dodecil-bD-maltosídeo, 3g / g de triton X-100, e 6g / g para digitonina.
   
   
7. Centrifugar o pellet solubilizados a 100.000 g por 15 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante límpido.
8. Adicionar tampão de carregamento para um final de 5% de glicerol w / v e 0,01% w / v Ponceau S (use um 50% de glicerol w / v, 0,1% w / v carregamento Ponceau S solução estoque regulador).
9. Carga poços de gel com um volume que contém 20-40mg do crude mitocondrial pellet por pista. Use um gel de gradiente de acrilamida (4% -13) com 3,5% de empilhamento gel.
   
   NOTA: Gel de preparação e condições de eletroforese:
   
   Para a preparação de gel, use um acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mix da seguinte forma: 48g de acrilamida e 1,5 g de bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Onde T é a concentração total de AA e bisAA e C é o percentual de reticulador (bisAA) para monômero total).
   
   Gel buffer (3 '): 1,5 M de ácido 6-aminohexanoic; imidazol 75mm, pH 7,0

Gel gradiente:	4%	13%	Empilhamento gel:	3,5%
AA / bisAA misture 3	2 ml	6,5 ml		0,6 ml
Gel tampão 3 '	8,3 ml	8,3 ml		2,7 ml
Glicerina		5 g
H 2 O	14,7 ml	5 ml		4,7 ml
Volume total	25 ml	25 ml		8 ml
APS 10%	139 mL	125 mL		67 mL
Temed	14 mL	12,5 mL		6,7 mL

Buffer de ânodo: 25mM imidazol / HCl, pH 7,0

Tampão cátodo: tricine 50mm, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltosídeo, 0,05% w / v desoxicolato, pH 7,0

Despeje e executar géis em uma sala fria (4-7 ° C). A tensão inicial usado é 100V. Quando a amostra entrou no gel de empilhamento, a tensão é elevada a 500V com a corrente limitada a 15mA (para 0,15 '14' 14 cm de gel). Eletroforese é interrompido após 3-4 h, quando a linha nítida de corante vermelho Ponceau S a abordagens frente gel. Alternativamente, um gel pode ser executado durante a noite com tensão constante de 70-100V.

1. Em gel de ensaios de atividade. O tempo de incubação para cada ensaio depende da eficiência de solubilização de proteína e da quantidade de material carregado por bem. Complexos I, IV e V costumam gerar sinais mais fortes do que os complexos II e III.

Complexo I (CI)

Incubar a fatia de gel com CI buffer (5mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) em temperatura ambiente por várias horas.

CI buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4:

0.01g NADH

0.25g NBT

Corrigir o gel em metanol 50% e 10% de ácido acético por 15-45 min. O gel é preservada fixo em 10% de ácido acético.

Complexo II (CII)

Incubar a fatia de gel com CII buffer (20mM de sódio succinato; methasulfate fenazina 0,2 mM; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) em temperatura ambiente por várias horas.

CII buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4:

Succinato de sódio 1M 200μl

Pipete 80 methasulfate fenazina (PMS 250mm dissolvido em DMSO)

0.25g NBT

Corrigir o gel como descrito para Complexo I

Complexo III (CIII)

Incubar a fatia de gel com CIII tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina (DAB)) em temperatura ambiente por várias horas.

CIII buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2:

50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina

Corrigir o gel como descrito para Complexo I

Complexo IV (CIV)

Incubar a fatia de gel com CIV tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina (DAB), o cavalo de 50 ìm coração citocromo c) em temperatura ambiente por várias horas.

CIV buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2:

50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina

Cavalo 0.1g coração citocromo c

Corrigir o gel como descrito para Complexo I

Complexo V (CV)

Incubar a fatia de gel com CV tampão (Tris-base de 35mm, 270mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14mm MgSO _4, 0,2% w / v Pb (NO _{3) 2,} 8MM ATP) em temperatura ambiente por várias horas.

CV buffer: 100 ml de solução por acrescentar:

Tris-base	0.424g
Glicina	2.026g
MgSO 4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

Não há necessidade de ajustar o pH (deve ser 8.3) - não use ácido ou base. Filtro e adicionar

ATP

0.441g

Corrigir o gel em metanol 50% por 30 min e transferência para a água.

Discussão

Neste vídeo, temos descrito a extração de complexos de proteína mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas, a sua separação por eletroforese em gel de alta resolução clara nativa (hrCNE), e posterior análise por gel em ensaios de atividade catalítica. hrCNE resolve complexos de proteína mitocondrial de membrana com uma resolução comparável à de eletroforese em gel azul nativa e é superior para os ensaios em gel atividade. Esta técnica pode ser empregada não apenas para quantificar respiratória mitocondrial ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M Sodium succinate	Fisher Scientific	S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2	Fisher Scientific	BP332-1 and BP329-1	Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)	EMD Millipore	9010	store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0	Sigma-Aldrich	I-2399	store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)	Fluka	37008-1G	Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid	Fluka	07260-100G	store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution	Sigma-Aldrich	P-3504 and G6279-1L	0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate	Fluka	30970-25G	Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)	TCI America	P0083	Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c From horse heart	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
100x protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at – 20 C.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypan blue Stain 0.4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0.5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Trypsin Inhibitor	GIBCO, by Life Technologies	17075-029