גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Summary

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.

Abstract

המיטוכונדריה הם אברונים cytoplasmic שיש להם תפקיד מרכזי במטבוליזם הומאוסטזיס הסלולר, הרגולציה של הרשת התא איתות, ועל מוות תאים מתוכנת. המיטוכונדריה לייצר ATP, להסדיר את המדינה חמזור cytoplasmic ו Ca2 + איזון, catabolize חומצות שומן, לסנתז heme, נוקלאוטידים, הורמונים סטרואידים, חומצות אמינו, לעזור להרכיב ברזל גופרית אשכולות בחלבונים. המיטוכונדריה יש גם תפקיד חיוני בייצור חום. מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי הגורם מספר סוגים של ההפרעה האנושית. הצטברות של מוטציות mtDNA בקורלציה עם הזדקנות חשוד יש תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן. בשל תפקיד חשוב ביותר שלהם בכל סוגי תאים, הפונקציה של המיטוכונדריה חייב גם להיות קריטי עבור בתאי גזע. ההתקדמות מפתח נעשו הבנתנו הכדאיות גזע תאים, התפשטות, ויכולת הבחנה. אבל את הפעילות התפקודית של בתאי גזע, מעמד מסוים האנרגיה שלהם, עדיין לא נחקרו בפירוט. כמעט דבר אינו ידוע על המאפיינים של המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והצאצאים שלהם מבשר מובחן. אחת הדרכים להבין ולהעריך את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד hESC ואת הפוטנציאל ההתפתחותי היא למדוד ישירות את הפעילות של מתחמי הנשימה במיטוכונדריה. כאן אנו מתארים ברזולוציה גבוהה ברור יליד ג'ל אלקטרופורזה ובעקבות ב להדמיה ג'ל הפעילות כשיטה לניתוח חמשת מתחמי שרשרת הנשימה של hESCs.

Protocol

רזולוציה גבוהה נקה Native ג'ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני

בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממוזג באמצעות תנאים סטנדרטיים. כדי להסיר זיהום MEFs, hESCs היו מחדש מצופה על Matrigel גדל במדיום MEF ממוזג עבור 3 ימים נוספים. מיקרוסקופיה immunofluorescence עבור סמנים pluripotency אוקטובר-4 ו SSEA-4 שימש כדי לאשר את חוסר בידול hESC.

1. לשטוף עם תאים חמים 1x PBS, pH 7.4, ואחריו trypsinization (1ml של 1x טריפסין היטב לכל צלחת 6-באר) במשך 5 דקות.
2. הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין טריים (ב 1mg/ml 1x PBS, pH 7.4). קציר תאים צנטריפוגות ב 200 גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
3. מחק את התאים pelleted supernatant ו resuspend ב 0.8 - 1.7ml (מבוסס על גודל תא גלולה) של קרח קר חיץ בידוד המיטוכונדריה (83mM סוכרוז; 6.6mM imidazole / HCl, pH 7.0) עם המוכן טרי קוקטייל "מעכבי פרוטאז 1. לדגור על הקרח במשך 10 דקות.
4. Dounce תאים עם homogenizer (~ 40-50 משיכות). הכתם aliquot של תאים dounced עם trypan כחול כדי לבדוק השלמות של homogenization באמצעות מיקרוסקופ אור.
5. צנטריפוגה ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גולמי המיטוכונדריה גלולה שמכיל גם גרעינים ושברי תאים גדולים יותר. למזוג וזורקים supernatant ולשקול גולמי זירז המיטוכונדריה גלולה. גלולה יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C בעקבות הקפאה מיידית של חנקן נוזלי אם זו נקודת עצירה.
   
   הערה: צנטריפוגה דיפרנציאלי או שיפוע מבוססי הליכים יכול לשמש לבידוד איסוף חלק טהור קרום המיטוכונדריה. ראו נ"צ. 4 לקבלת פרטים. גישה חלופית זו תניב את פעילות המיטוכונדריה מורכבים לכל מיליגרם של חלבון המיטוכונדריה במקום פעילות מורכבת לכל מיליגרם של משקל תא או מספר תאים. ריכוז של חלבונים במיטוכונדריה יהיה צורך נקבע לאחר טיהור לעשות את ההשוואה הזאת. כמו כן, חיץ בידוד שונים עשויים להידרש לגישה זו. עבור solubilization של חלק קרום טהור המיטוכונדריה, ראה את ההערה הבאה לשלב 6 למטה.
   
   
6. Solubilize הגולמי המיטוכונדריה גלולה על הקרח ידי vortexing עם חיץ קרים solubilization (NaCl 50mm, 50mm imidazole / HCl pH 7.0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic חומצה). חומצה 6-aminohexanoic יכול להיות מוחלף עם קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x. השתמש 35μl של חיץ solubilization לכל 20mg משקל גלולה. הוסף 20μl של 10% w / v digitonin לכל 20mg משקל גלולה ומערבבים ידי מצליף את הצינורית. דגירה של 50-10 דקות על הקרח. Dodecyl-BD-maltoside או טריטון X-100 ניתן להחליף digitonin כדי solubilize את החלבונים. הבחירה של חומר ניקוי וכמותו עלול להשפיע על היווצרות supercomplexes או צורות multimeric של קומפלקסים המיטוכונדריה. לקבלת מידע נוסף, ראה ref.1.
   
   הערה: כמות של חומר הניקוי הנדרש solubilize שבריר טהור קרום המיטוכונדריה המתאים יחס כביסה / חלבון משקל החל 2-6g / g. יחס אופטימלי solubilize ממברנות המיטוכונדריה היא 2.5G / g dodecyl-BD-maltoside, 3G / g טריטון X-100, ו - 6 גרם / g digitonin.
   
   
7. צנטריפוגה גלולה solubilized ב 100.000 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant ברור.
8. הוסף טעינה חיץ גליצרול הסופי w / v 5% ו 0.01% w / v Ponceau S (שימוש של 50% w / v גליצרול, 0.1% w / v החיץ טעינה S Ponceau פתרון המלאי).
9. טען בארות ג'ל עם נפח המכיל 20-40 מג של המיטוכונדריה גולמי גלולה לכל נתיב. השתמש שיפוע acrylamide ג'ל (4 -13%) עם 3.5% לערום ג'ל.
   
   הערה: הכנת ג'ל אלקטרופורזה ותנאים:
   
   להכנת ג'ל, השתמש acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 לערבב כדלקמן: 48g של acrylamide ו 1.5g של bisacrylamide (49.5% T, 3% ג T איפה הוא ריכוז מוחלט של AA ו bisAA ו-C הוא אחוז crosslinker (bisAA) כדי מונומר סה"כ).
   
   ג'ל חיץ (3 '): 6-1.5M aminohexanoic חומצה; imidazole 75mm, pH 7.0

צבע ג'ל:	4%	13%	הערמה ג'ל:	3.5%
AA / bisAA לערבב 3	2 מ"ל	6.5 מ"ל		0.6 מ"ל
ג'ל חיץ 3 "	8.3 מ"ל	8.3 מ"ל		2.7 מ"ל
גליצרול		5 גרם
H 2 O	14.7 מ"ל	5 מ"ל		4.7 מ"ל
סך נפח	25 מ"ל	25 מ"ל		8 מ"ל
10% APS	139 μl	125 μl		67 μl
TEMED	14 μl	12.5 μl		6.7 μl

חיץ האנודה: 25mm imidazole / HCl, pH 7.0

חיץ קטודה: Tricine 50mm, 7.5mM imidazole / HCl, 0.02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0.05% w / v deoxycholate, pH 7.0

יוצקים ולהפעיל ג'לים בחדר קר (4-7 מעלות צלזיוס). המתח הראשוני נעשה שימוש הוא 100V. כאשר המדגם נכנס ג'ל הערמה, המתח עולה עד 500V עם מוגבלות הנוכחית 15mA (0.15 עבור "14" 14 ס"מ ג'ל). אלקטרופורזה היא נעצרה לאחר 3-4 שעות, כאשר קו חד של צבע אדום Ponceau S גישות הקדמי ג'ל. לחלופין, ג'ל ניתן להפעיל ולינה 70-100V עם מתח קבוע.

1. In-ג'ל פעילות מבחני. זמן הדגירה של assay כל תלוי היעילות של solubilization חלבון כמות החומר טעון בכל טוב. תסביכים אני, IV ו-V בדרך כלל תשואה אותות חזקים יותר מתחמי II ו-III.

אני קומפלקס (CI)

דגירה את הפרוסה עם ג'ל CI חיץ (5mm טריס-HCl, pH 7.4, 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.

CI חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4:

0.01g NADH

0.25g NBT

תקן את ג'ל מתנול 50% חומצה אצטית 10% דק '15-45. הג'ל קבוע נשמרת חומצה אצטית 10%.

קומפלקס II (כת"ש)

דגירה את הפרוסה עם ג'ל CII חיץ (נתרן 20mm succinate; methasulfate phenazine 0.2mM; 2.5mg/ml NBT, 5mm טריס-HCl pH 7.4) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.

כת"ש חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4:

200μl נתרן 1M succinate

80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm מומס DMSO)

0.25g NBT

תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני

קומפלקס III (CIII)

דגירה את הפרוסה עם ג'ל CIII חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.

CIII חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2:

50 מ"ג tetrahydrochloride diaminobenzidine

תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני

קומפלקס IV (CIV)

דגירה את הפרוסה עם ג'ל CIV חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), לב 50μM סוס ציטוכרום c) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.

CIV חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2:

50 מ"ג tetrahydrochloride diaminobenzidine

לב 0.1g סוס ציטוכרום c

תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני

קומפלקס V (CV)

דגירה הפרוסה ג'ל עם קורות חיים חיץ (35mm טריס בסיס, גליצין 270mM, pH 8.3 במהירות של 25 ° C, 14mm MgSO _4, 0.2% w / v Pb (NO _{3) 2,} 8mm ATP) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.

קורות חיים למאגר: 100 מ"ל לכל פתרון להוסיף:

טריס בסיס	0.424g
גליצין	2.026g
MgSO 4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

אין צורך להתאים את ה-pH (צריך להיות 8.3) - לא להשתמש חומצה או בסיס. סנן ולהוסיף

ה-ATP

0.441g

תקן את ג'ל מתנול 50% למשך 30 דקות ומעבירים למים.

Discussion

בסרטון הזה, שתיארנו החילוץ של קומפלקסים חלבונים מן המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה שלהם על ידי אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה ברור ג'ל יליד (hrCNE), וכן על ידי ניתוח לאחר מכן ב-ג'ל מבחני פעילות קטליטית. hrCNE פותר המיטוכונדריה חלבון מתחמי ממברנה ברזולוציה דומה לזה של כח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	adjust pH to 8.0 with NaOH
1M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1M Sodium succinate	Fisher Scientific	S413-500
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2	Fisher Scientific	BP332-1 and BP329-1	Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)	EMD Millipore	9010	store at 4 C
1M imidazole/HCl, pH 7.0	Sigma-Aldrich	I-2399	store at 4 C
1M Tris-HCl, pH 7.4	Fisher Scientific	BP153-1
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)	Fluka	44205-500MG	Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C.
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)	Fluka	37008-1G	Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use.
2M 6-aminohexanoic acid	Fluka	07260-100G	store at 4 C
10x Ponceau S/glycerol stock solution	Sigma-Aldrich	P-3504 and G6279-1L	0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.
10% w/v sodium deoxycholate	Fluka	30970-25G	Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.
250 mM phenazine methasulfate (PMS)	TCI America	P0083	Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C.
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99%
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c From horse heart	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
100x protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Store at – 20 C.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypan blue Stain 0.4%	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0.5%)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Trypsin Inhibitor	GIBCO, by Life Technologies	17075-029