Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

Resumen

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Resumen

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), las células de alimentación, la forma de hESCs paso de placas MEF a la celda sin alimentador de placas Matrigel.

Protocolo

células madre de mantenimiento cultura cotidiana

1. los medios de comunicación la cultura células madre debe ser cambiado cada 24 horas. Desde el frasco ES medios se almacenan a 4 ° C, retirar la cantidad de solución necesaria (~ 20 ml por cada 6 y placa), en un tubo de 50 ml de halcón, y calentar a 37 ° C en un baño de agua. Una vez que los medios de comunicación se calienta, añade bFGF se almacenan a 4 ° C a una concentración final de 10ng/ml. Poner el stock de bFGF volver a 4 º C inmediatamente después de su uso!
2. Eliminar de las placas de 6 pocillos, pero todos ~ 500μl de los medios de comunicación. Asegúrese de girar la placa de cultivo de suspender los desechos para su eliminación. Asegúrese de que el bFGF en los medios de células madre a la cultura se mezcla y añadir 3 ml de medio fresco de nuevo a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Vuelva a colocar la placa en la incubadora.

HESCs división de MEFs en Matrigel

Por lo general, una confluencia de 6 pocillos de hESCs en MEFs se puede dividir 01:02-01:03 Matrigel en placas de 6 pocillos, con los pozos cada vez más confluentes 4-5 días después de partir.

1. Cuando hESCs dividir en Matrigel, MEF acondicionado medios de comunicación (CM) se utiliza para mantener la pluripotencialidad. MEF acondicionado medios de comunicación se realiza por adelantado. En el primer día, 1,5 × 10 ⁷ γ-irradiado MEFs se siembran en un frasco T75. En el segundo día, MEFs se lavan una vez con una temperatura ambiente de 1 × PBS, pH 7,4, y luego 15 ml de los medios de comunicación ES complementado con 5ng/ml bFGF se añade a la botella. (NOTA: MEFs se sembraron en frascos pequeños o más grandes, pero la proporción entre la densidad de las células y el volumen de los medios de comunicación ES debe ser constante.) El frasco se incuba a 37 ° C durante otras 24 horas. En el tercer día, el CM se recoge y se reemplaza con 15 ml de los medios de comunicación ES fresco suplementado con 5ng/ml bFGF. El CM recogidos se almacenan a 4 ° C. MEF acondicionado medios de comunicación de un revestimiento de MEFs se cosechan más de siete días consecutivos, para generar 15 x 7 = 105ml. Después de siete días, todas las fracciones de CM se reúnen, se filtra de manera estéril, alícuotas y almacenado a -20 ° C. Los medios de comunicación CM preparado como se describe puede ser almacenada y utilizada durante 1 mes.
2. Un día antes de partir células madre, puesto alícuotas de Matrigel en tubos Eppendorf a 4 ° C para descongelar la noche (una alícuota contiene 76.2mg de Matrigel, y esta es la cantidad necesaria para un 6 y placa). En el día de partir, tomar un vial de la Matrigel descongelado para una de 6 pocillos, ponga el vial y 6 ml de frío DMEM/F12 los medios de comunicación sobre el hielo. Transferir el Matrigel en el DMEM/F12 los medios de comunicación y mezclar bien. Añadir 1 ml de la solución a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Agitar la placa para distribuir Matrigel en la superficie y se incuba la placa Matrigel cubierto a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de la división de la hESCs.
3. hESCs en MEFs se lavan una vez con PBS 1X, pH 7,4. Posteriormente 1 ml de agua tibia IV colagenasa (1mg/ml) se añade a cada pocillo de la placa de 6 pocillos y luego la placa se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos.
4. Añadir 1 ml de los medios de comunicación ES sin bFGF a cada pocillo. Use una pipeta de 1 ml a soplar las células madre de la placa. Recoge todos los medios que contienen grupos de hESCs y MEFs muertos en un tubo de 50 ml de halcón. Vamos a grupos grandes de las células de resolver durante 5-10 minutos para que los grupos células madre forma una bolita en la parte inferior del tubo, mientras que el MEFs permanecen suspendidas en el sobrenadante. Descartar el sobrenadante y lavar por la resuspensión de células madre utilizando los medios de comunicación de pellets ES carece de bFGF, seguido de centrifugación a temperatura ambiente a 200 g por 5 min.
5. A la placa de las células madre en las placas de Matrigel, primero se deben lavar los platos Matrigel con la temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml por pocillo) y la adición de 2,5 ml de la CM complementado con 10ng/ml bFGF por pozo. Resuspender el precipitado en un volumen adecuado de CM complementado con 10ng/ml bFGF, pipeta la suspensión de células de arriba a abajo varias veces hasta que los grumos se uniforme y de tamaño pequeño. Alícuota de la suspensión a 0,5 ml por pocillo en la placa de Matrigel. Tenga en cuenta que la densidad de las colonias en Matrigel es mayor que la densidad de las colonias por la división habitual en MEFs. Colocar la placa en un 37 ° C tejidos incubadora de la cultura.
6. Para mantener la hESCs en Matrigel, los medios de comunicación CM complementado con 10ng/ml bFGF se cambia cada 24 horas durante un máximo de 4-5 días.

Discusión

Este video muestra cómo hESCs paso de placas MEF alimentador de placas Matrigel libres de células. Tenga en cuenta que la densidad de las colonias en Matrigel es mayor que la densidad de las colonias por la división habitual en MEFs. La tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo o microscopía para los marcadores de células madre pluripotencia, tales como Oct-4 y SSEA-4, son necesarios para confirmar el mantenimiento de hESCs en estado indiferenciado en condiciones de cultivo libre de alimentación.

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	Gibco	10828-028
DMEM/F12	Reagent	Gibco	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
GlutaMax	Reagent	Gibco	35050-061
DMEM	Reagent	Gibco	11995-065
FBS	Reagent	Clontech	631107
L-glutamine	Reagent	Gibco	25030-081
BME	Reagent	Fisher	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	Gibco	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.	715-095-152