De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

Resumo

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.

Resumo

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato embrionárias (MEF), as células de alimentação, como hESCs passagem de placas MEF para alimentação livre de células placas Matrigel.

Protocolo

manutenção CTEh cultura diária

1. meios de cultura CTEh deve ser trocada a cada 24 hrs. Do frasco estoque ES mídia armazenada a 4 ° C, retire a quantidade de solução necessária (~ 20ml por 6 bem-prato), coloque em um tubo falcon 50ml, e aquecido a 37 ° C em banho-maria. Uma vez que a mídia está aquecido, adicione bFGF armazenadas a 4 ° C para uma concentração final de 10ng/ml. Coloque o estoque bFGF volta a 4 ° C imediatamente após o uso!
2. Remover das placas de 6-bem todos, mas ~ 500μl dos meios de comunicação. Certifique-se de rodar o prato cultura para suspender a remoção de detritos. Verifique se o bFGF nos meios de cultura CTEh é bem misturado e adicionar 3 ml de mídia fresco volta a cada poço de uma placa de seis poços. Volte a colocar a placa na incubadora.

HESCs divisão de MEFs para Matrigel

Normalmente, uma placa de 6 bem-confluentes de hESCs em MEFs pode ser dividida 01:02 - 01:03 para Matrigel placas 6-bem, com os poços se tornar confluentes novamente 4-5 dias após a divisão.

1. Quando hESCs divisão em Matrigel, MEF-condicionado media (CM) é usado para manter pluripotência. MEF-condicionado mídia é feito antecipadamente. No primeiro dia, 1,5 × 10 ⁷ γ irradiados MEFs são semeadas num frasco T75. No segundo dia, MEFs são lavadas uma vez com temperatura ambiente 1 × PBS, pH 7,4, e em seguida 15ml de mídia ES suplementado com 5ng/ml bFGF é adicionado ao balão. (NOTA: MEFs pode ser banhado em frascos menores ou maiores, mas proporção entre a densidade das células e volume de mídia ES deve ser constante.) O balão é incubados a 37 ° C por mais 24 hrs. No terceiro dia, o CM é coletado e substituído com 15ml de mídia ES fresco suplementado com 5ng/ml bFGF. O CM coletadas são armazenadas a 4 ° C. MEF-condicionado media de um revestimento de MEFs são colhidas ao longo de sete dias consecutivos para gerar 15 × 7 = 105ml. Após sete dias, todas as frações CM são combinados, estéril filtrado, aliquotado e armazenado a -20 ° C. Media CM preparado como descrito podem ser armazenadas e usadas por 1 mês.
2. Um dia antes de se separarem CTEh, coloque Matrigel alíquotas em tubos eppendorf a 4 ° C para descongelar durante a noite (uma alíquota contém 76.2mg de Matrigel, e esta é a quantidade necessária para uma placa de 6 poços). No dia da divisão, tome um frasco do Matrigel descongelado para uma placa de 6 poços, coloque o frasco e 6ml de frio DMEM/F12 media no gelo. Transferir o Matrigel no DMEM/F12 mídia e misture bem. Adicionar 1 ml da solução a cada poço de uma placa de seis poços. Redemoinho a placa para distribuir Matrigel na superfície e incubar a placa Matrigel coberto em temperatura ambiente por pelo menos 1 hr antes da divisão do hESCs.
3. hESCs em MEFs são lavadas uma vez com 1 × PBS, pH 7.4. Posteriormente 1ml de quente colagenase IV (1mg/ml) é adicionado a cada poço da placa 6-bem e, em seguida, a placa é incubada a 37 ° C por 5-10 min.
4. Adicionar 1ml de mídia ES sem bFGF a cada poço. Use uma pipeta de 1ml para fundir as células-tronco fora do prato. Recolher todos os meios contendo aglomerados de hESCs e MEFs mortos em um tubo falcon 50ml. Deixe aglomerados de células grandes contentar com 5-10 min para que as touceiras CTEh formar um pellet no fundo do tubo, enquanto a MEFs permanecem suspensas no sobrenadante. Desprezar o sobrenadante e lavar pela ressuspensão do pellet CTEh usando mídia ES faltando bFGF, seguido por centrifugação a temperatura ambiente em 200g por 5 min.
5. Para a placa de células-tronco em placas Matrigel, primeiro lave os pratos Matrigel com temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml por poço) e adicionar 2,5 ml de CM suplementado com 10ng/ml bFGF por poço. Ressuspender o sedimento em um volume adequado de CM suplementado com 10ng/ml bFGF, pipetar a suspensão célula para cima e para baixo várias vezes até que os pedaços se tornar uniforme e de pequena dimensão. Alíquota da suspensão de 0,5 ml por poço na placa Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Coloque a placa em um 37 ° C de cultura de tecidos incubadora.
6. Para manter a hESCs em Matrigel, media CM suplementado com 10ng/ml bFGF é trocada a cada 24 horas até 4-5 dias.

Discussão

Este vídeo demonstra como hESCs passagem de placas MEF para as placas de alimentação livre de células Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Imunofluorescência e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como Oct-4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado em condições de alimentação livre de cultura.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	Gibco	10828-028
DMEM/F12	Reagent	Gibco	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
GlutaMax	Reagent	Gibco	35050-061
DMEM	Reagent	Gibco	11995-065
FBS	Reagent	Clontech	631107
L-glutamine	Reagent	Gibco	25030-081
BME	Reagent	Fisher	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	Gibco	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.	715-095-152