De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

Résumé

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

Résumé

Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) cellules nourricières, comment CSEh passage de plaques MEF pour chargeur de pile plaques sans Matrigel.

Protocole

l'entretien de la culture quotidienne de CSEh

1. milieux de culture des CSEh doivent être changés toutes les 24 heures. De la bouteille ES stock de médias stockés à 4 ° C, sortir la quantité de solution nécessaire (~ 20ml par 6-même plaque), placer dans un tube de 50ml Falcon, et chaud à 37 ° C dans un bain d'eau. Une fois que le média est réchauffé, ajouter le bFGF conservés à 4 ° C à une concentration finale de 10ng/ml. Mettez le stock bFGF revenir à 4 ° C immédiatement après usage!
2. Retirer des plaques de 6 puits, mais tous les ~ 500μl de médias. Assurez-vous de tourbillonner la boîte de culture de suspendre pour l'enlèvement des débris. Assurez-vous que le bFGF dans les milieux de culture des CSEh est bien mélangé et ajouter 3 ml de milieux frais de retour à chaque puits d'une plaque à 6 puits. Remettez la plaque dans l'incubateur.

Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

Habituellement, un confluentes 6-même assiette de CSEh le FAE peut être divisé 1:02-1:03 sur Matrigel plaques de 6 puits, avec les puits deviennent confluentes à nouveau 4-5 jours après fractionnement.

1. Lorsque CSEh fractionnement sur Matrigel, MEF conditionné médias (CM) est utilisé pour maintenir la pluripotence. MEF-médias est conditionnée à l'avance. Le premier jour, 1,5 × 10 ⁷ γ-irradiés FAE sont ensemencées dans un flacon T75. Le deuxième jour, FAE sont lavés une fois avec une température ambiante x PBS, pH 7,4, puis 15ml de médias ES complétée par 5ng/ml bFGF est ajouté dans le ballon. (REMARQUE: FAE peuvent être étalées dans des flacons plus petits ou plus gros, mais la proportion entre la densité cellulaire et du volume des supports ES doit être constante.) Le flacon est incubé à 37 ° C pendant 24 heures. Le troisième jour, le CM est collectée et remplacé par 15 ml de médias ES frais complété avec 5ng/ml bFGF. Le CM collectées sont stockées à 4 ° C. MEF-conditionnée des médias d'un placage de FAE sont récoltées pendant sept jours consécutifs de générer 15 × 7 = 105ml. Après sept jours, toutes les fractions sont combinées CM, filtration stérile, aliquotés et conservés à -20 ° C. CM des médias préparé comme décrit peut être stockée et utilisée pour 1 mois.
2. Un jour, avant de se séparer de CSEh, mis aliquotes dans des tubes eppendorf Matrigel à 4 ° C à dégeler la nuit (une aliquote contient 76.2mg de Matrigel, et ceci est la quantité nécessaire pour un 6-même plaque). Le jour de fractionnement, de prendre un flacon de Matrigel décongelées pour un 6-même assiette, mettre le flacon et 6ml de froid DMEM/F12 des médias sur la glace. Transférer le matrigel dans le DMEM/F12 médias et bien mélanger. Ajouter 1 ml de la solution à chaque puits d'une plaque à 6 puits. Swirl la plaque de distribuer Matrigel en surface et incuber la plaque recouverte de Matrigel à température ambiante pendant au moins 1 heure avant de se séparer du CSEh.
3. CSEh le MEF sont lavées une fois avec 1 x PBS, pH 7,4. Par la suite 1ml d'eau tiède collagénase IV (1mg/ml) est ajouté à chaque puits de la plaque de 6 puits, puis la plaque est incubée à 37 ° C pendant 5-10 min.
4. Ajouter 1ml de médias ES sans bFGF à chaque puits. Utiliser une pipette 1 ml de faire sauter les cellules souches de la plaque. Recueillir tous les médias contenant des touffes de CSEh et morts FAE dans un tube 50ml Falcon. Laissez gros amas de cellules se contenter de 5-10 min pour que les touffes de CSEh forment un culot au fond du tube tandis que la FAE restent en suspension dans le surnageant. Jeter le surnageant et laver à la remise en suspension le culot de CSEh ES en utilisant les médias manquent de bFGF, suivie par une centrifugation à température ambiante à 200g pendant 5 min.
5. Pour plaque de cellules souches sur des plaques de Matrigel, d'abord laver les assiettes avec Matrigel DMEM/F12 température ambiante (1ml par puits) et en ajoutant 2,5 ml de CM complété avec 10ng/ml bFGF par puits. Reprendre le culot dans un volume approprié de CM complété avec 10ng/ml bFGF, une pipette la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois jusqu'à l'amas devient uniforme et de petite taille. Aliquoter la suspension à 0,5 ml par puits sur la plaque de Matrigel. Notez que la densité des colonies sur Matrigel est plus élevée que la densité des colonies par fractionnement d'habitude sur le FAE. Placer la plaque dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur.
6. Pour maintenir la CSEh sur Matrigel, les médias CM complétée par 10ng/ml bFGF est changé toutes les 24 heures pour un maximum de 4-5 jours.

Discussion

Cette vidéo montre comment les CSEh passage de plaques MEF pour les plaques d'alimentation Matrigel sans cellule. Notez que la densité des colonies sur Matrigel est plus élevée que la densité des colonies par fractionnement d'habitude sur le FAE. Immunofluorescence et cytométrie de flux pour microscopie ou marqueurs de pluripotence des CSEh, tels que Oct-4, SSEA-4, sont nécessaires pour confirmer l'entretien des CSEh dans un état indifférencié dans les conditions de culture nourricier libre.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	Gibco	10828-028
DMEM/F12	Reagent	Gibco	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
GlutaMax	Reagent	Gibco	35050-061
DMEM	Reagent	Gibco	11995-065
FBS	Reagent	Clontech	631107
L-glutamine	Reagent	Gibco	25030-081
BME	Reagent	Fisher	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	Gibco	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.	715-095-152