Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

Riepilogo

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 2 di 3.

Abstract

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione, come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel.

Protocollo

hESC manutenzione cultura quotidiana

1. terreni di coltura hESC deve essere cambiato ogni 24 ore. Dalla bottiglia ES magazzino multimediali memorizzati a 4 ° C, estrarre la quantità di soluzione necessaria (~ 20ml per 6 pozzetti), posto in un tubo da 50 ml falco, e calda a 37 ° C in un bagno d'acqua. Una volta che la media è riscaldato, aggiungere bFGF conservato a 4 ° C ad una concentrazione finale di 10ng/ml. Mettete il brodo bFGF torna a 4 ° C subito dopo l'uso!
2. Togliere dal 6 pozzetti tutti ma ~ 500μl dei media. Assicurati di agitare il piatto cultura di sospendere i detriti per la rimozione. Assicurarsi che il bFGF in terreni di coltura del hESC sia ben mescolata e aggiungere 3 ml di mezzi freschi di nuovo in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatrice.

HESC scissione dal MEF sul Matrigel

Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC sul MEF possono essere divisi 1:02-1:03 su Matrigel piatti 6-bene, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione.

1. Quando hESC suddivisione su Matrigel, MEF condizionata media (CM) è usato per mantenere la pluripotenza. MEF condizionata media è in anticipo. Il primo giorno, 1,5 × 10 ⁷ γ-irradiati MEF sono seminati in un pallone T75. Il secondo giorno, MEF vengono lavati una volta con temperatura ambiente 1 × PBS, pH 7,4, e poi 15 ml di media ES integrato con 5ng/ml bFGF si aggiunge al pallone. (NOTA: MEF può essere placcato in fiasche più piccole o più grandi, ma proporzione tra la densità delle cellule e il volume dei mezzi di comunicazione ES deve essere costante.) Il pallone viene incubata a 37 ° C per altre 24 ore. Il terzo giorno, il CM è raccolto e sostituito con 15 ml di media ES fresca integrato con 5ng/ml bFGF. Il CM raccolto viene conservato a 4 ° C. MEF condizionata da una placcatura mezzi di MEF sono raccolte più di sette giorni consecutivi di generare 15 × 7 = 105ml. Dopo sette giorni, tutte le frazioni CM sono combinati, sterile filtrata, aliquotati e conservati a -20 ° C. Mezzi di comunicazione CM preparato come descritto possono essere memorizzati e utilizzati per 1 mese.
2. Un giorno prima divisione hESC, messo aliquote Matrigel in tubi eppendorf a 4 ° C per scongelare tutta la notte (una aliquota contiene 76.2mg di Matrigel, e questo è l'importo necessario per un 6-pozzetti). Il giorno della scissione, prendere un flaconcino di Matrigel scongelati per un 6-pozzetti, mettere il flaconcino e 6 ml di freddo DMEM/F12 multimediale su ghiaccio. Trasferire il Matrigel nel DMEM/F12 media e mescolare bene. Aggiungere 1 ml della soluzione in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Agitare la piastra per distribuire Matrigel sulla superficie e incubare il Matrigel coperto di piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di dividere la hESC.
3. hESC il MEF sono lavati una volta con 1 × PBS, pH 7,4. Successivamente 1 ml di caldo collagenasi IV (1mg/ml) viene aggiunto in ciascun pozzetto della piastra ben 6 e poi la piastra viene incubata a 37 ° C per 5-10 min.
4. Aggiungere 1ml di media ES senza bFGF in ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta 1 ml di far saltare le cellule staminali fuori dal piatto. Raccogliere tutti i supporti contenenti grumi di hESC e morti MEF in una provetta da 50 ml falco. Lasciate grumi di cellule grandi accontentarsi di 5-10 minuti in modo che le macchie hESC forma una pallina sul fondo della provetta mentre il MEF rimangono sospese nel supernatante. Eliminare il supernatante e lavare da risospendere il pellet mezzi hESC ES manca bFGF, seguita da centrifugazione a temperatura ambiente a 200 g per 5 min.
5. Alla piastra le cellule staminali su piastre Matrigel, prima lavare i piatti Matrigel con temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml per pozzetto) e l'aggiunta di 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù parecchie volte fino a quando le macchie diventano uniformi e di piccole dimensioni. Aliquota la sospensione a 0,5 ml per pozzetto sul piatto Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore.
6. Per mantenere la hESC su Matrigel, media CM integrato con 10ng/ml bFGF è cambiato ogni 24 ore per un massimo di 4-5 giorni.

Discussione

Questo video mostra come hESC passaggio da piastre MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel. Si noti che la densità colonia su Matrigel è superiore alla densità delle colonie dividendo consueto MEF. Immunofluorescenza e la citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Oct-4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato di alimentazione priva di condizioni di coltura.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152