マトリゲル上のMEFから分割ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル2〜

要約

このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。 3パート2。

要約

このビデオでは、どのようにMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートへ継代ヒトESへのマウス胚性線維芽細胞（MEF）をフィーダー細胞上のヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）、成長する方法を示します。

プロトコル

ヒトES細胞の培養日常のメンテナンス

1. ヒトES細胞の培養培地は、すべて24時間を変更する必要があります。 4℃で保存したESメディアストックボトルから、（6ウェルプレートあたり〜20ml）を必要な液量を、50ミリリットルファルコンチューブの場所、そして℃の水浴中で37に暖かいを取り出します。メディアが暖めされると、10ng/mlの最終濃度に4℃で保存されているbFGFを° Cを追加。 4でのbFGFの株式を元に戻します° C使用後はすぐに！
2. すべてが、メディアの500μL〜に6 - ウェルプレートから取り外します。除去のための破片を中断するスワール培養皿に確認してください。ヒトES細胞培養培地中のbFGFは徹底的に混合され、6ウェルプレートの各ウェルに戻って新鮮な培地の3ミリリットルを追加してください。バックインキュベーター内でプレートを置く。

マトリゲル上のMEFから分裂ヒトES細胞

通常のMEF上でヒトES細胞のコンフルエント6ウェルプレートは6ウェルプレートにウェルは4-5日の分割後に再び合流になると、マトリゲルに1:3 1:2に分割することができます。

1. マトリゲル、MEF -馴化培地（CM）に分割すると、ヒトES細胞は多能性を維持するために使用されている場合。 MEF -馴化培地は、事前に行われます。初日には、1.5 × 10 ^7γ線照射したMEFのはT75フラスコ中に播種されています。二日目は、MEFのは、室温1 × PBS、pH7.4で一回洗浄し、その後、5ng/mlのbFGFを添加したESメディアの15ミリリットルをフラスコに添加される。 （注：MEFのは、小さいまたは大きなフラスコに播種することができますが、細胞密度とESのメディアのボリュームの比率を一定にする必要があります。）フラスコをさらに24時間、37℃でインキュベートする。三日目に、CMは5ng/mlのbFGFを添加した新鮮なESのメディアの15ミリリットルを採取し、置換されます。収集されたCMは、4℃で保存されていますMEFのいずれかのめっきからMEF -馴化培地は、15 × 7 = 105ミリリットルを生成するための連続した​​7日間にわたって収穫されています。 7日後に、すべてのCMの画分を一緒にされ、滅菌濾過し、分注し、-20℃で保存のように調製したCMのメディアが保存され、1ヶ月に使用することができます。
2. ヒトES細胞の分裂前のある日は、℃で一晩解凍する4でエッペンドルフチュー​​ブにマトリゲルのアリコートを入れて（一方のアリコートは、マトリゲルの76.2mg含まれている、とこれは1 6ウェルプレートに必要な量です）。分割の日に、1つの6 - wellプレートのために解凍マトリゲルの1バイアルを取る、氷の上に冷たいDMEM/F12メディアのバイアルと6ミリリットルを入れて。 DMEM/F12メディアにマトリゲルを移し、よく混ぜる。 6ウェルプレートの各ウェルに解決策の1ミリリットルを追加。渦巻板は、表面にマトリゲルを配布し、分割ヒトES細胞を前に、少なくとも1時間室温でマトリゲルで覆わ​​れたプレートをインキュベートする。
3. MEFの上でヒトES細胞を1 × PBS、pH7.4で一回洗浄する。暖かいコラゲナーゼIV（1mg/ml）のその後1ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルに添加し、その後、プレートを37℃でインキュベートされた℃で5〜10分間。
4. 各ウェルにbFGFをせずにESのメディアの1ミリリットルを追加。プレートから幹細胞を爆破する1ミリリットルピペットを使用してください。 50ミリリットルファルコンチューブにヒトESと死者MEFの塊を含むすべてのメディアを収集する。 MEFのは、上清中に浮遊したままでhESCの塊がチューブの底にペレットを形成するように細胞の大きな塊が5〜10分間のために解決しましょう​​。上清を捨て、5分間200グラムで、室温で遠心分離に続いて、bFGFを、欠けているESのメディアを使用してヒトES細胞ペレットを再懸濁することにより洗浄。
5. プレートマトリゲルプレート上の幹細胞をするには、まず室温DMEM/F12（ウェル当たり1ミリリットル）とウェルあたり10ng/mlのbFGFを添加したCMの2.5ミリリットルを加えるとマトリゲルプレートを洗浄する。塊のサイズが均一で小さくなるまで上下に数回を10ng/mlのbFGFを添加したCM、ピペット細胞懸濁液の適切な量のペレットを再懸濁します。マトリゲルプレートのウェルあたり0.5ミリリットルでのアリコートはサスペンション。マトリゲル上でコロニーの密度がMEFの上に通常の分割により、コロニーの密度より高いことに注意してください。 37℃の組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
6. マトリゲル上でヒトES細胞を維持するために、10ng/mlのbFGFを添加したCMのメディアが4〜5日までの毎24時間に変更されます。

ディスカッション

このビデオでは、どのように通過ヒトESへMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートに示しています。マトリゲル上でコロニーの密度がMEFの上に通常の分割により、コロニーの密度より高いことに注意してください。このようなOCT - 4およびSSEA - 4、などのhESCの多能性マーカー、のための免疫蛍光染色し、顕微鏡またはフローサイトメトリーは、フィーダーを含まない培養条件で未分化?...

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	Gibco	10828-028
DMEM/F12	Reagent	Gibco	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
GlutaMax	Reagent	Gibco	35050-061
DMEM	Reagent	Gibco	11995-065
FBS	Reagent	Clontech	631107
L-glutamine	Reagent	Gibco	25030-081
BME	Reagent	Fisher	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	Gibco	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.	715-095-152