Espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis)

Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia

Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) es uno de las más populares técnicas analíticas porque es muy versátil y capaz de detectar casi cualquier molécula. Con espectroscopía UV-Vis, la luz de UV-Vis se pasa a través de una muestra y se mide la transmitancia de la luz por una muestra. De la transmitancia (T), la absorbancia se puede calcular como A =-log (T). Un espectro de absorbancia se obtiene que muestra la absorbancia de un compuesto en diferentes longitudes de onda. La cantidad de la absorbancia a cualquier longitud de onda es debido a la estructura química de la molécula.

UV-Vis se puede utilizar de una manera cualitativa, para identificar grupos funcionales o confirmar la identidad de un compuesto haciendo coincidir el espectro de absorbancia. También puede ser utilizado de manera cuantitativa, como concentración del analito se relaciona la absorbancia con la ley de Beer. Espectroscopía UV-Vis se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN o proteínas en una muestra, para análisis de aguas y como un detector para muchos tipos de cromatografía. Cinética de las reacciones químicas se miden también con espectroscopía UV-Vis tomando medidas repetidas de UV-Vis con el tiempo. UV-Vis son generalmente mediciones con un espectrofotómetro. UV-Vis es también un detector muy popular para otras técnicas analíticas como la cromatografía, pueden detectar muchos compuestos.

Por lo general, UV-Vis no es la técnica de espectroscopia más sensible, porque no mucha luz es absorbida sobre una longitud de ruta corta. Otras técnicas de espectroscopia tales como de fluorescencia tienen mayor sensibilidad, pero no son como generalmente aplicables, como la mayoría de las moléculas no es fluorescente. UV-Vis tiene una sensibilidad similar a otras mediciones de absorbancia, tales como espectroscopia de infrarrojo.

UV-Vis se denomina una técnica general porque la mayoría de las moléculas se absorbe en el rango de longitud de onda de UV-Vis. La UV se extiende de 100 – 400 nm y el espectro visible de 400-700 nm. El rango de 100 – 200 nm se llama UV profundo. Fuentes de luz son más difíciles de encontrar para esta gama, así que no es utilizado rutinariamente para las medidas de UV-Vis. Espectrómetros UV-Vis típico utilizan una lámpara de deuterio para Ultravioleta que produce luz de 170 – 375 nm y una lámpara de filamento de tungsteno para visible, que produce luz de 350 – 2.500 nm.

Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida a un estado energético más excitado. Luz UV-visible tiene la suficiente energía para promocionar electrones a un estado electrónico más alto, desde el orbital molecular ocupado más alto (HOMO) al menor orbital molecular desocupado (LUMO). La diferencia de energía entre el HOMO y el LUMO se llama el boquete de la venda. Por lo general, estos orbitales se llaman vinculación y anti-bonding. La energía del fotón debe coincidir exactamente con el boquete de la venda de los fotones absorbidos. Así, las moléculas con estructuras químicas diferentes tienen huecos de banda de energía diferentes y diferentes espectros de absorción. Las transiciones más comunes que caen en el rango UV-Vis son π-π * y n - π *. Orbitarios del pi se presentan debido a dobles enlaces, y números orbitales son para los electrones de no enlace. Estrella de PI son orbitales pi de anti-bonding. Así, la mejor absorción de UV-Vis es por moléculas que contienen enlaces dobles. PI orbitarios adyacentes que están conectadas, llamado Conjugación, por lo general aumenta la absorción. Sigma-σ * transiciones, asociadas con enlaces sencillos, es una energía más alta y caen en el ultravioleta profundo, por lo que son menos útiles para el uso rutinario. La aparición de amplias bandas u hombros sobre la estructura de UV-Vis es debido a los numerosos Estados vibracionales y rotacionales de una molécula, que separan las lagunas de banda de energía de energías ligeramente diferentes.

Para moléculas con absorción en la región visible, los compuestos a menudo aparecerá coloreados. Sin embargo, una idea falsa común es que la longitud de onda del máximo de absorción (λ_max) para un compuesto es el color que aparece. Un compuesto que aparece rojo no tiene mucha absorción en la región roja del espectro. En cambio, el λ_máximo para un compuesto que parece rojo es verde. El color de un compuesto se presenta porque las longitudes de onda de la luz selectivamente se transmiten a través de la muestra, y por lo tanto no se absorben. Una rueda de color es útil para determinar qué color va a absorber un compuesto y qué rango el λ_máximo será, como el color directamente a través de la rueda desde el color observado es el color que más absorbe.

La absorción sigue ley de Beer, A = εbC donde ε es el coeficiente de atenuación molar, b es la longitud de la ruta, y C es la concentración. El coeficiente de atenuación molar es la característica de un compuesto individual para absorber en una longitud de onda determinada y esta propiedad se debe a grupos funcionales, verbal, etcetera. Si un compuesto no tiene un alto coeficiente de atenuación, podría ser etiquetado con un grupo adecuado para aumentar su absorción. Longitud del camino generalmente se relaciona con el tamaño de la cubeta y es 1 cm en espectrofotómetros estándar.

UV-Vis se realiza en una variedad de instrumentos, desde Espectrofotómetros tradicionales a más lectores de placa moderna. La longitud de onda de absorbancia debe ser elegido, ya sea mediante un filtro o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa las longitudes de onda de luz espacial y luego coloca una rendija de salida donde es la longitud de onda deseada de la luz. Monocromadores pueden digitalizarse para proporcionar un espectro de absorbancia todo. Por otra parte, un instrumento de arreglo de diodos permite todos los colores de la luz transmitida a través de la muestra, entonces la luz se separa en diferentes longitudes de onda espacial y detecta el uso de fotodiodos. Instrumentos de arreglo de diodos reunir espectros completos más rápido, pero son más complicados y más caros.

1. calibrar el espectrómetro

1. Encienda el espectrómetro UV-Vis y las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo (alrededor de 20 min) para estabilizarlos.
2. Llenar una cubeta con el solvente de la muestra y asegúrese de que el exterior esté limpio. Esto servirá como un espacio en blanco y ayudar a responsables de pérdidas de luz debido a la dispersión o la absorción por el disolvente.
3. Coloque la cubeta en el espectrómetro. Asegúrese de alinear correctamente la cubeta, como a menudo la cubeta tiene dos caras, que sirven para la manipulación (puede ser acanalado) y no pretenden iluminar a través de.
4. Se hace una medición para el espacio en blanco. La absorbancia debe ser mínima, pero cualquier absorbencia debe restarse de muestras futuras. Algunos instrumentos pueden almacenar los datos en blanco y realizar la resta automáticamente.

2. realizar un espectro de absorbancia

1. Llene la cubeta con la muestra. Para asegurarse de que la transferencia es cuantitativa, enjuagar la cubeta dos veces con la muestra y luego llenarlo aproximadamente 3/4 completo. Asegúrese de que el exterior esté limpio de huellas digitales, etcetera.
2. Coloque la cubeta en el espectrómetro en la dirección correcta.
3. Cubrir la cubeta para evitar cualquier luz ambiental.
4. Recoge un espectro de absorbancia al permitir que el instrumento para la exploración a través de diferentes longitudes de onda y recoger la absorbancia. La gama de longitud de onda se puede configurar con información sobre la muestra específica, sino un rango de 200 – 800 nm es estándar. Un instrumento de arreglo de diodos es capaz de recoger un espectro de absorbancia todo en una carrera.
5. Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorción (λ_máx.). Repetir la colección de espectros para obtener una estimación de error en λ_max.
6. Para hacer una curva de calibración, recoger el espectro UV-Vis de una variedad de muestras de diferente concentración. Espectrómetros están a menudo limitados en rango lineal y no será capaces de medir un valor de absorbancia mayor que 1.5. Si los valores de absorbancia de la muestra están fuera del rango lineal del instrumento, diluir la muestra para obtener los valores dentro del rango lineal.

3. cinética experimentos con espectroscopía UV-Vis

1. UV-Vis se puede utilizar para experimentos de cinética examinando el cambio de absorbancia con el tiempo. Para un experimento de cinética, tome una lectura inicial de la muestra.
2. Agregar rápidamente el reactivo para iniciar la reacción química.
3. Revuelve bien para mezclar con la muestra. Si se agrega una pequeña cantidad, esto se podría hacer en una cubeta. Alternativamente, mezclar el reactivo con la muestra y vierta rápidamente en una cubeta para una medición.
4. Medir la absorbancia a la λ_max para el analito de interés en el tiempo. Si utilizar el reactivo se mide (es decir la absorbancia esta subiendo porque hay menos reactivo a absorber), entonces el decaimiento indicará el orden de la reacción.
5. Usando una curva de calibración, haga una parcela de tiempo de vs de concentración de analito, convertir el valor de absorbancia en concentración. A partir de ahí, este gráfico se puede caber con las ecuaciones apropiadas para determinar las constantes de velocidad de reacción.

UV-Vis se puede utilizar para obtener un espectro de compuestos coloreados. En la figura 1A, se muestra el espectro de absorción de un colorante azul. El fondo muestra los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene una absorbancia_máxima λ en naranja y rojo. Figura 1B muestra un espectro de un tinte rojo, con λ_max en el verde.

Cinética puede ser medida de una parcela de la absorbancia a una longitud de onda en el tiempo. La figura 2 muestra un diagrama de la absorción de un colorante azul (a 630 nm) que reacciona con el cloro.

Figura 1. Espectros de absorción UV-Vis. A. azul tinte #1 tiene la máxima absorbancia en naranja y rojo. B. rojo tinte #40 tiene absorbancia máxima en el verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. UV-Vis para cinética. Absorción de colorante azul #1 que reacciona con el cloro. La curva se puede caber con un decaimiento exponencial, que indica la cinética de primer orden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

UV-Vis se utiliza en muchos análisis químicos. Se utiliza para cuantificar la cantidad de proteína en una solución, como la mayoría de las proteínas absorbe fuertemente a 280 nm. Figura 3 muestra un ejemplo de los espectros de citocromo C, que tiene una alta absorbancia a 280 y 450 debido a un grupo hemo. UV-Vis también se utiliza como una técnica estándar para cuantificar la cantidad de ADN en una muestra, como todas las bases absorben fuertemente a 260 nm. RNA y proteínas también absorben a 260 nm, por lo que puede medir absorbancia a otras longitudes de onda para detectar interferencias. Específicamente, las proteínas se absorben fuertemente a 280 nm, por lo que la proporción de absorbancia a 280/260 puede dar una medida de la proporción de proteína a ADN en una muestra.

Simple mayoría de los análisis mide la absorbancia una longitud de onda a la vez. Sin embargo, información más química está presente si las mediciones se hacen en muchas longitudes de onda simultáneamente. Arreglo de diodos instrumentos captura toda la luz que se transmite, dividida la luz en diferentes colores mediante un prisma o una rejilla holográfica, y absorbancia a diferentes longitudes de onda es capturada en un arreglo lineal de fotodiodos. La ventaja de este método es útil para medir muchas moléculas diferentes simultáneamente.

Figura 3. Espectro UV-Vis de una proteína. El pico a 280 nm es indicativa de una proteína. El pico en el 450 es debido a la absorción del grupo hemo del citocromo C.