Parte 1: Extracción de ARN total utilizando el reactivo TRIzol Cuando se trabaja con el ARN es muy importante para trabajar en un ambiente libre de RNAsas. Precauciones simples como tener pipetas reservados para uso exclusivo con los procedimientos de ARN y la pulverización de la zona de trabajo con un reactivo descontaminante (por ejemplo, RNAsa Away) antes de iniciar el procedimiento es muy útil. <ol><li> Para lograr una suficiente cantidad de ARN de embriones de pez cebra piscina de 50 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta. </li><li> Inmediatamente añadir 250 l de reactivo TRIzol 1 al tubo de microcentrífuga que contiene los embriones. TRIzol reactivo contiene fenol y sólo debe utilizarse bajo una campana de humos. </li><li> Lisis y homogeneizar los embriones con una mano de pellet (aproximadamente 20 golpes) hasta que el tejido es suficientemente perturbado. </li><li> Cuando las células son lo suficientemente homogeneizado, añadir 750 l de reactivo TRIzol igual a un volumen total de 1 ml. </li><li> Para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína, incubar muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. En esta etapa, la muestra puede ser flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o el protocolo se puede continuar. </li><li> Para continuar añadir 0,2 ml de cloroformo y oscilar el tubo durante 15 segundos para mezclar. </li><li> Incubar la muestra durante 2 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> La mezcla se separará en una menor rojo de fenol-cloroformo fase, una interfase, y un descolorido fase acuosa superior. La fase acuosa superior contiene el ARN. La capa superior debe formar parte de alrededor del 60% del volumen inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). La transferencia de la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo utilizando una pipeta de 1 ml con cuidado de no transferir ninguna de la capa de interfase. </li><li> Para precipitar el ARN añadir 0,5 ml de isopropanol. </li><li> Dejar que la muestra llegue a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C. ARN se forma una bolita de gel en la parte inferior del tubo. </li><li> Sin perturbar el sedimento, separar el sobrenadante con una pipeta y se lava el precipitado en 1 ml de etanol al 75%. Mezclar la muestra por inversión suave y centrifugar a 7500 xg durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, separar el etanol con una pipeta y que la muestra se seque mientras está invertido durante 10 minutos. </li><li> Resuspender el pellet añadiendo 100 l de RNasa libre de agua e incubar la muestra a 55 ° C durante 10 minutos. Se recomienda a los dedos del vórtice con frecuencia durante la incubación para ayudar en la rehidratación de ARN. Si lo desea, puede comprobar la calidad y cantidad de la muestra con un ND-1000 espectrofotómetro NanoDrop o directamente pasar a la siguiente etapa. </li></ol> Parte 2: El ARN de limpieza utilizando el Qiagen RNeasy Mini Kit El Qiagen RNeasy Mini Kit 2 es útil en la eliminación de los contaminantes y las impurezas de una muestra de ARN aislado de otros métodos. Para este procedimiento, β-mercaptoetanol, el etanol y el agua libre de nucleasa se necesitan, además de los componentes incluidos en el kit. Una opción de tratamiento con ADNasa se recomienda durante este procedimiento. <ol><li> Tras el primer uso del kit, Buffer RPE deberán ser preparados por la adición de 4 volúmenes de etanol al 100% para un volumen de buffer RPE. </li><li> En el día del procedimiento, el tampón RLT tendrá que estar preparado fresco. Calcular la cantidad total de RLT buffer que se necesitarán. Un volumen de 350 l que se necesita por muestra. Para preparar el tampón RLT, añadir 10 l de β-mercaptoetanol por cada 1 ml de solución tampón. Esto debe hacerse bajo la campana de humos. </li><li> Para cada muestra se añaden 350 l de tampón RLT y 250 l de etanol al 100%. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Transferir la muestra, que debe ser de aproximadamente 700 l, en una columna RNeasy que se coloca en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de centrifugar, descartar el flujo a través y añadir 700 l de tampón RW1 a una columna de giro RNeasy. </li><li> Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego descartar el flujo a través. </li><li> Tratamiento con DNAsa Qiagen Kit RNasa libre de DNasa: DNAsa tratamiento es opcional, pero es muy recomendable para las muestras de la más alta calidad. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Al recibir el kit de tratamiento de DNAsa, tendrá que preparar la solución de DNAsa I de valores mediante la adición de 550 l de nucleasa libre de agua a la DNAsa. Mezclar suavemente por inversión y no del vórtice. Alícuotas en viales de un solo uso con 10 l de la solución madre. Puede almacenar la solución madre a -20 ° C durante un máximo de 9 meses. Las alícuotas descongeladas se pueden almacenar a 4 ° C durante 6 semanas si es necesario, pero no volver a congelar las alícuotas después de la descongelación. </li><li> Para preparar la mezcla de DNasa I incubación añadir 70 l de búfer DDR a 10 l s DNAsa Itac solución por muestra. Mezclar por inversión suave y tubo de centrífuga brevemente para recoger el líquido residual de los lados del tubo. Añadir 80 l DNAsa mezcla de incubación que directamente a la columna de centrifugación RNeasy. Incubar el tratamiento DNAsa durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Después del tratamiento con DNAsa añadir 350 l RW1 Buffer a la columna de centrifugación y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación descartar el flujo a través de RPE y añadir 500 l de búfer en la columna de giro. Incubar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y desechar el flujo a través. </li><li> Después de la centrifugación añadir 500 l de etanol al 75% en la columna de giro. </li><li> Repetir la centrifugación a 8.000 xg, pero durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación descartar el flujo a través de la columna y permitir que se seque durante 5 minutos. </li><li> Inmediatamente se centrifuga a 8000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar a la izquierda sobre los rastros de etanol. </li><li> Después de la centrifugación es la transferencia completa de la columna de centrifugación en un nuevo tubo de 1.5 ml de recogida y se añaden 10 l agua libre de nucleasa. Incubar durante 1 minuto y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. El ARN estará en el flujo a través. </li><li> Añadir otro l 10 de agua libre de nucleasa a la columna de centrifugación y se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación retirar y desechar la columna de giro. ARN estará en el flujo a través. </li><li> Comprobar la cantidad y calidad del ARN utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Además, corre un gel de desnaturalización o de utilizar un Agilent 2100 Bioanalyzer para comprobar la integridad del ARN. </li><li> Las muestras deben ser almacenadas a -80 ° C hasta que la síntesis de ADNc se puede realizar. </li></ol> Parte 3: Síntesis de cDNA utilizando la Invitrogen superíndice primer capítulo del Sistema El ARN es fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas que conduce a la degradación. Como resultado, muchos protocolos de expresión de los genes se han desarrollado para utilizar un producto de cDNA más estable que ha sido directamente sintetiza a partir del ARN. Aquí detallamos la síntesis de cDNA primer capítulo con la Invitrogen superíndice primer capítulo de síntesis del sistema tres. Cada reacción de síntesis de cDNA con capacidad para 5 g de ARN. <ol><li> Antes de iniciar el procedimiento de mezcla y centrifuga brevemente cada componente. </li><li> Prepare ARN / mezcla de imprimación en un tubo de microcentrífuga estéril 0,5 ml como se indica en la Tabla 1. </li><li> Incubar la muestra a 65 ° C durante 5 minutos. </li><li> Inmediatamente la transferencia de muestras de suspensión de hielo durante 10 minutos. </li><li> Mientras que la muestra se enfría preparar una mezcla maestra con los componentes descritos en la Tabla 2. Los volúmenes están indicadas por una reacción. Ajustar los volúmenes de acuerdo con el número total de reacciones. </li><li> Después de enfriar, añadir 9 l de la mezcla maestra preparada en el paso 5 para cada ARN / mezcla de imprimación. Mezclar suavemente y recoger por centrifugación breve. El volumen total de cada muestra debe ser de 19 l. </li><li> Incubar la muestra a 42 ° C durante 2 minutos en un termociclador. </li><li> Añadir 1 l (50 unidades) de superíndice II RT a cada tubo, mezclar e incubar a 42 ° C durante 60 minutos en un termociclador. </li><li> Terminar la reacción a 70 ° C durante 15 minutos y luego se muestra frío a 4 ° C. Un termociclador puede ser programado para los pasos 8 y 9. </li><li> Después de la muestra ha llegado a 4 ° C, la transferencia de la reacción a un baño de hielo. </li><li> En el hielo añadir 1 l de RNasa H a cada tubo y se incuba durante 20 minutos a 37 ° C. El volumen total es ahora de 21 microlitros. Además de RNasa H en la muestra se degrada el ARN molde y dejar sólo el producto de cDNA único. </li></ol> Parte 4: Aislamiento de ADNc y precipitación <ol><li> A 1,5 ml de la fase de bloqueo del tubo de gel se utiliza en el aislamiento del producto de cDNA. Preparar un 1,5 ml de fase de bloqueo del tubo de gel mediante centrifugación a 12.000 xg durante 2 minutos. El gel debe ser todo en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 81,5 l de fenol (Tris-saturadas, tamponada a pH 8,0), 81,5 l de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, y la muestra (21 l) en el tubo de gel de fase de bloqueo. Mezcla varias veces por inversión suave. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> El cDNA debe estar en la fase acuosa superior. Transferir la fase superior a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml. El volumen total debe ser de alrededor de 20 microlitros. </li><li> Añadir 1X volumen de 3 M NaOAc, pH 5,2 y mezclar suavemente. Por ejemplo, si el volumen de la fase acuosa superior era igual a 20 l, tendrá que añadir 2 l de 3 M NaOAc, pH 5,2. </li><li> Añadir 7 l de 5 mg / ml de glucógeno y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 1X volumen de isopropanol y mezclar suavemente. En general, esta es de unos 30 l de isopropanol. </li><li> Que la muestra de incubar a temperatur ambientee durante 10 minutos y centrifugar a 12.000 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Una pequeña bolita de cDNA que se forman en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta. </li><li> Añadir 500 l de etanol al 70% y mezclar por inversión. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos. </li><li> Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta y repetir el lavado de etanol al 70% y centrifugación (medidas 10 y 11). </li><li> Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta. Si no es el líquido residual en los lados del tubo, que puede ser recogida por una breve gira el tubo. Elimine cualquier exceso de líquido y permitir que se seque el precipitado a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Añadir 20 l de agua libre de nucleasa para rehidratar la pastilla. Coloque la muestra a 55 ° C durante 5 minutos para la rehidratación de la pastilla. </li><li> La cantidad y la calidad del producto de cDNA se comprueba utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA se pueden almacenar a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Después de la limpieza de ARN, de aproximadamente 15 g de ARN de alta calidad total se puede esperar a partir de 50 embriones de pez cebra. Para evaluar la calidad total de ARN, un espectrofotómetro, electroforesis en gel, y un Bioanalyzer Agilent 2100 puede ser utilizado. ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro se puede utilizar para evaluar la absorbancia a 260 nm en comparación con la absorbancia a 280 nm (Figura 1). El A 260 / A 280 puede revelar la presencia de contaminantes y dar pruebas de una posible degradación. Un 260 / A 280 de 1,9-2,0 se considera aceptable. Además, es altamente recomendable que un gel de desnaturalización del ARN puede ejecutar para evaluar la integridad del ARN. Cadenas de ARN se separan en función de su tamaño, con menor migración de líneas más abajo en el gel. Una muestra no degradada, aparecerá como una prueba con dos bandas muy resistentes. La citología es el resultado de una población de diferentes cadenas de ARNm de tamaño y las bandas correspondientes a 28S y 18S ARNr. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S (Figura 2). Por otra parte, el total de la integridad del ARN se puede evaluar utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos distintos que representan el rRNA 28S y 18S se espera (Figura 3). El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dos picos distintos, no se observó en muestras degradadas. RNA de muestras que exhiban degradación no debe ser llevado a través de posteriores procedimientos experimentales. La prueba espectrofotométrica se puede utilizar para evaluar la calidad del producto de cDNA (Figura 4). El A 260 / A 280 debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 g de ARN total rutinariamente rendimiento mg 1-2 de cDNA producto en nuestro laboratorio. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un espectro NanoDrop de muestra de RNA. Después de la limpieza de ARN, ARN cantidad y la calidad se puede evaluar con un ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro. Aproximadamente 15 mg de ARN total de alta calidad de forma rutinaria dado a partir de 50 embriones de pez cebra con un A 260 / A 280 alrededor de 1.9-2.0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un gel de desnaturalización del ARN. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, un gel de desnaturalización del ARN se puede correr. Una prueba con dos bandas brillantes que corresponden a 28S y 18S ARNr se espera. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un rastro de una muestra de ARN de una bioanalizador. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, las muestras pueden ser analizadas en un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos agudos, que corresponde al 28S y 18S rRNA, debe ser visible. El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un espectro NanoDrop de una muestra de DNA. La prueba espectrofotométrica con un NanoDrop ND-1000 se puede utilizar para evaluar la cantidad y calidad del producto de cDNA. El A 260 / A 280 debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 ug de RNA total rutinariamente rendimiento 1.2 ug de cDNA en nuestro laboratorio. Tabla 1. Componentes para añadir el RNA / mezclas de imprimación en el paso 2 de la síntesis de cDNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> El ARN total (hasta 5 g) </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / l) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Agua tratada con DEPC </td><td> n l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Mezcla de reacción para el paso 5 de la síntesis de cDNA. Los volúmenes indicados son por reacción. Aumentar los volúmenes de cada componente para el número total de reacciones. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 10X Buffer RT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La fragilidad de la molécula de ARN es la consideración más importante que debe tenerse en cuenta a lo largo de este protocolo. Material estéril que se RNasa libre siempre debe ser utilizado en una zona de RNasa libre del laboratorio. Es de gran ayuda para reservar una parte del laboratorio que deberán utilizarse para los procedimientos de ARN solamente. Esta área debe ser rociado con frecuencia con un producto de la eliminación de RNAsa, como la RNAsa lejos. El RNA de muestras siempre deben ser manejados con gua...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Muchos procedimientos de laboratorio importantes y complejas requieren una entrada de alta calidad, el ARN intacto. Una muestra degradada o la presencia de impurezas puede llevar a resultados desastrosos en posteriores aplicaciones experimentales. Por lo tanto, de suma importancia el uso de técnicas sólidas con numerosas salvaguardias y controles de calidad para asegurar una muestra superior. Aquí, los detalles de un protocolo para aislar el ARN total a partir de embriones de pez cebra con todo un desnaturalizante químico disponible en el mercado y la limpieza posterior para eliminar los rastros de ADN y las impurezas mediante un kit comercial de aislamiento de ARN. Como el ARN es relativamente inestable y fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas, la mayoría de los protocolos de ensayo de expresión génica utilizando un producto de cDNA que está directamente sintetizado a partir de una plantilla de ARN. Se detalla un procedimiento para convertir el ARN en el producto más estable cDNA utilizando un kit disponible comercialmente. A lo largo de estos procedimientos existen numerosos controles de calidad para asegurar que la muestra no es degradadas o contaminadas. El producto final de estos protocolos es cDNA que es adecuado para el análisis de microarrays, RT-PCR o el almacenamiento a largo plazo.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.7K vistas.  Purdue University. El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...