La inmunohistoquímica de montaje completo es una técnica relativamente rápida y sencilla que permite la observación espacial y temporal de proteínas directamente en un tejido u organismo utilizando anticuerpos etiquetados. La utilidad de esta técnica es que permite la tinción de un tejido intacto o un organismo sin tener que secarlo primero y la microscopía confocal se puede utilizar para generar una representación tridimensional del patrón de expresión de proteínas. La inmunohistoquímica es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para entender la etiología y los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad.
También es una valiosa herramienta de diagnóstico para identificar tumores en muestras patológicas. Para empezar, prepare tanques de desove llenos de agua del sistema y con una malla o forro ranurado en su lugar. Coloque parejas de sexo mixto de peces cebra adultos en grupos en los tanques durante la noche.
Utilice un ciclo de luz/oscuridad de 14 horas/10 horas con luces encendidas a las 9 a.m. A la mañana siguiente, con las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove con agua fresca del sistema para eliminar las heces. Una vez que los huevos se ponen, devolver a los adultos a los tanques caseros.
Recoger los huevos por elaborarlos utilizando una pipeta de transferencia. Transfiera 50 huevos a cada plato de Petri lleno a mitad de camino con un medio embrionario. Retire los huevos opacos y nublados que estén muertos o que no se dividan.
Incubar el plato de huevos a 28,5 grados centígrados hasta 23 horas después de la fertilización. Si los embriones son mayores de 24 horas después de la fertilización, con una pipeta transfiera los embriones a 200 PTU micromolares en un medio embrionario para prevenir la melanogénesis. Bajo un microscopio estéreo, descorionar los embriones sin rayar usando fórceps de punta ultra fina.
Usando pipetas Pasteur pulidas por fuego para minimizar el daño, transfiéralas a platos Petri de vidrio o plástico recubiertos con 1-2% de agarosa disuelta en medio embrionario. A continuación, transfiera los embriones a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de plástico o pulida por el fuego. Retire el medio embrionario con una micropipeta.
Deje sólo suficiente líquido para cubrir los embriones. Fije los embriones en 4%PFA durante una o dos horas con un suave balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lave los embriones tres veces en 1X PBS y 1%PBTriton durante cinco minutos.
Utilice los embriones inmediatamente o guárdelos a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para el almacenamiento a largo plazo, deshidratar y almacenar los embriones en 100% metanol a menos 20 grados Celsius. Para rehidratar los embriones, realice incubaciones en serie cinco minutos cada una a temperatura ambiente con cantidades decrecientes de metanol y PBS y PBTriton para el lavado final.
Proceda con la preparación del embrión de acuerdo con el manuscrito. Seleccione una solución de bloqueo que coincida con las especies anfitrionas de anticuerpos secundarios, por ejemplo 10% de suero de cabra en PBTriton con o sin dos miligramos por mililitro de BSA. Añadir 0,5 mililitros de la solución de bloqueo en el tubo que contiene el embrión y colocar el tubo en un balancín durante una a tres horas a temperatura ambiente.
Luego incubar el embrión en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo y PBTriton durante la noche a cuatro grados Celsius mientras se balancea. Por la mañana, lave el embrión cinco veces en PBTriton durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea. A continuación, seleccione un anticuerpo secundario basado en la especie huésped del anticuerpo primario y la longitud de onda deseada a 488 nanómetros.
Añadir el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo en el tubo que contiene el embrión. Cubra el tubo con papel de aluminio e incubar durante dos horas a temperatura ambiente mientras se balancea. Después de eso, lave los embriones tres veces en PBTriton durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras está cubierto con papel de aluminio y balanceo.
Con una pipeta, transfiera los embriones a una solución de 50% de glicerol en PBS sobre un lecho de 2% de agarosa en medio embrionario. Para quitar la yema, transfiera 200 microlitros de 1X PBS a un portaobjetos de depresión o a un portaobjetos de vidrio plano. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para mover uno o más embriones a la gota PBS.
Utilice fórceps ultra finos y pasadores de insectos de doble cero para romper la yema y raspar muy suavemente los gránulos de yema de la superficie ventral del embrión. Retire los gránulos de yema y reponga con PBS según sea necesario. Después del montaje, coloque la muestra en la etapa del microscopio.
Busque la región de interés seleccionando un ejemplo relativamente brillante. Ajuste la exposición y la ganancia de la cámara para que la señal sea lo suficientemente brillante sin saturación. Cuando se compare entre los embriones experimentales etiquetados con anticuerpos y los embriones de anticuerpos de control, utilice los mismos ajustes de exposición.
Este protocolo de inmunohistoquímica de montaje completo es una herramienta valiosa para el estudio de la expresión de proteínas espaciales y temporales utilizando el desarrollo de peces cebra. La subunidad GluN1 del receptor de glutamato tipo NMDA reveló la expresión de subunidades del receptor de glutamato a lo largo del desarrollo de los músculos del pez cebra a las 23 horas después de la fertilización. Secciones congeladas de embriones post fertilización de 72 horas se montaron en diapositivas e inmunosutened para fosfo-H3, un marcador de células proliferantes.
Varias células expresaron fosfo-H3 y la expresión fue más notable en las zonas ventriculares. Los anticuerpos de control IgG de ratón y la exclusión de los anticuerpos primarios revelaron un bajo nivel de expresión no específica. Es importante seleccionar soluciones de bloqueo adecuadas y anticuerpos secundarios basados en las especies anfitrionas de anticuerpos primarios para asegurar la detección y minimizar las manchas no específicas.
La inmunohistoquímica debe verificarse para garantizar que la señal observada sea realmente la proteína de interés. Los experimentos de seguimiento generalmente implican el uso de organismos modificados genética o ambientalmente. La inmunohistoquímica otorga a los investigadores la capacidad de observar proteínas in situ, acelerando en gran medida nuestra comprensión de numerosos sistemas en biología básica y aplicada, particularmente durante el desarrollo embrionario.
El metanol y el formaldehído son tóxicos y deben manipularse cuidadosamente. Los desechos deben recogerse y eliminarse de acuerdo con los procedimientos institucionales.
