We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. Transcripción in vitro <ol><li> Linealizar pCS2-H2A.F / vectores pCS2-mCherry-CAAX Z-EGFP y / o por la restricción NotI digestión con enzimas de 31. El uso de un ARN en el kit de transcripción in vitro, generar 5 &#39;de ARNm de productos tapados de cada plantilla, según el protocolo del fabricante. </li><li> Se purificó el ARNm cubrieron usando un kit de purificación. Siga las instrucciones del fabricante. Eluir con RNasa libre de H 2 O. </li><li> Determinar la concentración de ARN por absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro. (OD 260 x dilución x 40 g / ml). </li><li> Se diluye la ARN a 100 ng / l para cada H H2A.F / Z-EGFP y mCherry-CAAX con RNasa libre de 2 O. Si la concentración de ARN es demasiado baja, la fluorescencia se verá disminuida o ausente. muestras más brillantes van a disminuir las preocupaciones sobre la fototoxicidad y photobleaching. Por otro lado, el exceso de RNA puede ser tóxico y / o causar efectos fuera de destino. Nota: Guarde el restantemRNA purificado en -80 ° C congelador. </li></ol> 2. cría de pez cebra, recogida de embriones, y el ARNm de inyección 36-38 <ol><li> Montar tanques de cría con una barrera para separar el depósito en dos regiones y llenar cada tanque de cría con agua sistema de acuicultura utilizados en las instalaciones de pez cebra. </li><li> Con el fin de prevenir la reproducción prematura, colocar dos peces machos en un lado de la barrera y dos peces hembra en el otro lado de la noche antes de criar. </li><li> Al día siguiente, la mezcla se descongele ARNm preparado previamente en hielo. Reemplazar el agua en los tanques de cría con agua sistema de acuicultura fresco y eliminar las barreras. Inmediatamente después de que las barreras se tira, calentar un molde de inyección de 28,5 ° C y configurar el equipo para la microinyección. Nota: Para obtener información sobre los moldes de inyección, por favor refiérase a Gerlach 36. </li><li> Recoger los huevos cada 10 - 15 min usando un colador de té y enjuagar los huevos en un lugar limpio 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul (5 mM NaCl, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% azul de metileno). E3 azul se utiliza para prevenir el crecimiento de hongos y asegurar el desarrollo adecuado de las larvas de peces. Para obtener más información sobre el apareamiento y la recogida de embriones, consulte Gerlach 36 y 37 Porazinkski. </li><li> Insertar una célula puesta en escena embriones en un molde de inyección calentado e inyectar el ARN en la yema de huevo en la cantidad deseada de embriones (Figura 1A). Cuenta de muerte embrionaria natural y embriones fertilizados mediante la realización de inyecciones embrionarias, el 15% más embriones de los necesarios para el experimento. Para detalles adicionales sobre la microinyección de embriones de pez cebra, por favor refiérase a Gerlach 36 y 37 Porazinkski. NOTA: Para el primer uso del ARNm, realizar un análisis de dosis-curva para determinar la dosis óptima para la fluorescencia y la viabilidad (definida como ausencia de defectos en el desarrollo brutos de hasta 5 dpf) antes de la realización de imágenes 5D. 150-200 ng / linyecta en embriones es a menudo la concentración óptima, por lo tanto es un buen punto de partida para la concentración final. </li><li> extraer cuidadosamente los embriones inyectados desde el molde utilizando un 9 &quot;pipeta Pasteur de vidrio modificado. Para modificar la pipeta, fundir el extremo usando un mechero Bunsen hasta que se forme una bola. </li><li> Colocar los embriones inyectados en una placa de Petri de 100 x 15 mm en el E3 azul y la casa en una incubadora a 28,5 °. </li><li> Seis horas después de la inyección, eliminar cualquier embriones muertos o no fecundados de las placas y añadir limpia E3 azul. La casa de los embriones a 28,5 ° C. </li></ol> 3. Preparación e incrustación de embriones de pez cebra en vivo de la Imagen (Figura 1B) <ol><li> Dos horas antes de exponer, defender los embriones inyectados para GFP usando un microscopio de disección fluorescente. Lugar luminoso embriones que expresan GFP verdes en un nuevo 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul. </li><li> Hervir una solución madre de 1% de agarosa de baja fusión mediante la adición de 1 g de baja fusión de agarosa a 100 ml de azul E3. Después de usar la agarosa, cubrir el matraz con papel de aluminio. La solución madre sigue siendo útil para un máximo de un mes. </li><li> Alícuota 3 ml del agar derretido en un tubo de cultivo de 17 x 100 mm. Mantener caliente el agarosa al colocar el tubo de cultivo en un baño de agua a 42 ° hasta que esté listo para su uso. Preparar una solución de 15 mM tricaína en agua desionizada para anestesiar a los embriones de pez cebra 36. NOTA: Si se desea formación de imágenes en los puntos de tiempo anteriores, la concentración de agar se puede disminuir tan bajo como 0,3% 39. </li><li> Llevar el Tricaína 15 mM, embriones seleccionados, agarosa de bajo punto de fusión en, E3 azul, y un cubreobjetos de vidrio cultivo de fondo placa de 35 mm a un microscopio de luz disección. Retirar con cuidado corion del embrión con # 5 pinzas. Haga esto por tres embriones. </li><li> Colocan los embriones dechorionated en un recipiente separado para ser anestesiados. La tapa de la placa cubreobjetos parte inferior se utiliza a menudo para este propósito. Usando una pipeta de transferencia, añadir tres gotas (aproximadamente 150 l)Tricaína de 15 mM para el plato de 5 ml E3 azul (si se utiliza la tapa de la placa inferior cubreobjetos) o hasta que los embriones han sido suficientemente anestesiado. Además, añadir 3-4 gotas (aproximadamente 150 a 200 l) de solución 15 mM tricaína al tubo de agarosa fundida al 1%. </li><li> Con una pipeta P200 con 1 cm de la punta de la pipeta de corte; transferir los embriones anestesiados al plato cubreobjetos de fondo. Eliminar cualquier exceso de E3 azul: solución Tricaína. </li><li> Añadir lentamente 5 - 10 l de agarosa bajo punto de fusión: solución tricaína en los embriones, manteniendo cada gota separada para asegurar que los embriones no accidentalmente la deriva cerca uno del otro. Advertencia: Si la agarosa es demasiado caliente, se puede dañar el embrión. Una buena temperatura para mantener el agar a es 42 ° C. </li><li> Utilizando una aguja de 1 ½ 21 G, orientar suavemente el embrión en la agarosa a la posición deseada. Cuando se utiliza un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo, orientar la región de interés (ROI) tan cerca del cubreobjetos como possibLe. Nota: Para propósitos generales, la región de la cola ofrece facilidad de orientación y claridad debido al tejido relativamente delgada (Figura 1A). Otros tejidos, tales como la capa epitelial que rodea a los pliegues de la yema y de la aleta, se pueden utilizar 28,29. Estos tejidos ofrecen una gran claridad, sin embargo, estas regiones son sólo unas pocas capas de células de espesor. Para los fines de este protocolo, es beneficioso para la imagen de la región de la cola de adquirir como de muchas divisiones celulares como sea posible. </li><li> Deje pasar unos minutos para la solidificación parcial del agar. Utilice la aguja para romper un pequeño trozo de agar para probar su solidificación. Cuando una pieza de agar se separó de la caída, proceder al siguiente paso. </li><li> Cubrir todo el cubreobjetos con la formación de agar de fusión bajo una cúpula sobre los embriones embebidos. Dejar que el agar se solidifique antes de mover el plato para formación de imágenes confocal (Figura 1A). </li><li> Durante el proceso de solidificación agar (tarda aproximadamente 10 min), preparar 3 ml of solución E3 azul con cinco gotas de (250 l aproximadamente) Tricaína 15 mM a ser colocado sobre los embriones incorporados durante la exploración. </li></ol> 4. 5D Imagen confocal de embriones de pez cebra en vivo 40,41 NOTA: Ver Ariga 40 y O&#39;Brien 41 para obtener detalles sobre cómo realizar imágenes 5D utilizando otros sistemas confocal. Para Z-intervalo, pila Z, Z-profundidad, intervalo de tiempo, y las definiciones 5D véase la Figura 1C. <ol><li> Abra el software de imagen y establecer el microscopio 60X ND 1.4 lente objetivo. Aplicar aceite de inmersión de la lente del objetivo y coloque la placa de cultivo en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Utilizando el controlador de eje, centrar el embrión de interés por encima de la lente objetivo y llevar la lente del objetivo hacia arriba para cubrir la placa de cultivo. </li><li> Haga clic en el icono del ocular y cambiar el filtro de GFP en el microscopio. Centrarse en el retorno de la inversión. Centrándose en el tejido más cercano a la cubreobjetos se offer los mejores resultados de imagen. </li><li> Retire el enclavamiento. Seleccionar los canales de GFP y mCherry (longitudes de onda preestablecidas en el software) y establecer la línea de opciones a la normalidad promedio. </li><li> Use &quot;Controles Vista / Adquisición / A1 área de escaneado&quot; comando para abrir la herramienta A1 área de escaneado. </li><li> Empezar a escanear. Utilizando el eje controlador, coloque el embrión de manera que el área de escaneado se llena con la mayor cantidad de pez cebra como sea posible. La potencia del láser no tiene que ser óptima en este punto. Bajar la potencia del láser para evitar photobleaching innecesaria. </li><li> Utilice la opción &quot;Controles Vista / Adquisición / adquisición ND&quot; comando para abrir el panel de control de adquisición de ND. </li><li> Iniciar la exploración para establecer los parámetros Z-stack. Establecer el límite superior de Z-pila para que las células no están en foco y el límite inferior a la que las células ya no son visibles. Permitir un espacio 3 m por encima de la muestra para el crecimiento y el movimiento celular, que puede expandirse en el campo de la imagen. El Z-pila para las cifras que se muestran en este proProtocolo cubrió una Z-profundidad de 40 m en la cola del embrión. </li><li> Ajuste el tamaño de paso-Z intervalo de 2 micras. En promedio, una célula es 10 m de diámetro; por lo tanto, 2 micras producirá cinco intervalos de datos de imagen para ser analizados para cada celda. NOTA: La profundidad de la imagen que puede ser adquirida depende del intervalo Z. Resolución Z se sacrificó para ganar profundidad total en la dimensión Z con el fin de imagen tantas células en mitosis como sea posible (Z gran profundidad). El inverso es cierto, en el que, al disminuir el tamaño de paso, la resolución Z se gana, mientras que la profundidad Z se sacrifica (pequeña Z-profundidad). </li><li> Ajustar la potencia de imagen por láser, HV, y compensar los niveles. Para los experimentos demostraron en este protocolo, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles establecidos en los planos correspondientes, respectivamente, para el canal de GFP; 2-5, 120-140, y -9 a -11. Para el canal mCherry, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles, respectivamente; 3-6, 120-140, y -3 a-8. Una vez establecidos los parámetros, apague el escáner láser para evitar la exposición innecesaria que puede causar fototoxicidad y photobleaching de la muestra. </li><li> Seleccione el icono de promedio línea de 2x. &quot;No promediado&quot; produce una imagen granulada, mientras que &quot;la línea 4x promedio&quot; aumenta drásticamente el tiempo de exploración. Utilización de promedios línea 2x proporciona la mejor calidad de imagen y menor tiempo de exploración. </li><li> Seleccione la duración del intervalo de tiempo y el tiempo apropiado necesario para el experimento. Por divisiones de tipo salvaje, los intervalos de tiempo de dos minutos durante 2 horas es lo mejor para la determinación de la duración mitótico (utilizado en las figuras 1, 2, 3A y 3B). Divisiones que activan el punto de control de ensamblaje del huso durante más de 30 min son más adecuados para intervalos de cinco minutos durante cuatro horas con el fin de preservar la fluorescencia como se ha demostrado en la Figura 3C. </li><li> Marque la casilla &quot;guardar en el archivo&quot; y el nombre del archivo para guardar automáticamente el archivo, ya que se está adquiriendo. Vuelva a comprobar todos los paparáme- se establecen correctamente y pulsa &quot;Iniciar la ejecución&quot;. </li><li> Después de la adquisición se haya completado, para ver el archivo en un formato tridimensional, haga clic en el icono del umbral de volumen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El uso de este método permite inferir ruptura nuclear sobre, formación de una placa de la metafase por adjuntos microtúbulos del cinetocoro, y segregación de las cromátidas hermanas para formar dos nuevas células en vivo y de una manera dependiente del tiempo. La capacidad de observar la mitosis en el pez cebra es ventajoso sobre muestras fijadas y sistemas de cultivo celular, porque las células están siendo fotografiado en la fisiología natural, el tejido es transparente, que permite para las proteín...

La mitosis es un proceso celular esencial crítica para el crecimiento, la diferenciación y la regeneración en un organismo vivo. Tras la preparación exacta y la replicación del ADN en la interfase, la célula se prepara para dividirse. La primera fase de la mitosis, la profase, se inicia por la activación de la ciclina B / Cdk1. Profase se caracteriza por la condensación de material de cromatina en los cromosomas. rotura de la envuelta nuclear se produce en la transición entre la profase y prometaphase. En prometaphase, los centrosomas, el centro de nucleación para la formación del huso, comienzan a migrar hacia los polos opuestos mientras extiende los microtúbulos en busca de la unión cinetocoro. Tras la unión, las conversiones hasta final de microtúbulos en el apego y las fuerzas de tensión se orientan los cromosomas que forman una placa de la metafase 1. Si todos los cromosomas están conectados correctamente, el puesto de control conjunto del husillo se satisface, anillos cohesinas que llevan a cabo las cromátidas hermanas juntas se escinden, y los microtúbulos acortar para tirar de la hermanacromátidas hacia los polos opuestos durante la anafase 2,3. La fase final, la telofase, implica el alargamiento de la célula y la reforma de la envoltura nuclear alrededor de los dos nuevos núcleos. La citocinesis completa el proceso de división separando el citoplasma de las dos nuevas células hijas 4-6. La alteración de las principales vías de la mitosis (es decir, punto de control de ensamblaje del huso, la duplicación del centrosoma, cromátida hermana de cohesión, etc.) Puede resultar en la detención de la metafase, missegregation de cromosomas, y la inestabilidad genómica 7-10. En última instancia, los defectos en las vías de mitosis control pueden causar trastornos del desarrollo y el cáncer, que requiere la visualización de la mitosis y de sus defectos en una, vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16. embriones de pez cebra sirven como un gran organismo modelo para la formación de imágenes en vivo debido al tejido transparente, facilidad de microinyección, y el desarrollo rápido. El uso de pez cebra, el objetivo general de este manuscrito esdescriben un método de 5D en vivo (dimensiones X, Y, Z, el tiempo y longitud de onda) de formación de imágenes de mitosis 17 (Figura 1C). El uso de pez cebra mutante defectuoso en diferentes vías mitóticas demostrar la consecuencia de tales defectos. Para este protocolo, Aurora B y ESCO2 mutantes fueron elegidos para ilustrar estos defectos. Aurora B es una quinasa que es parte del complejo de cromosoma de pasajeros (CPC) que participan en la formación del huso y la unión de los microtúbulos. También se requiere para la formación de división surco en la citocinesis 18,19. En el pez cebra, la deficiencia de Aurora B conduce a defectos en la inducción surco, la citocinesis, y la segregación de los cromosomas 20. ESCO2, por otro lado, es una acetiltransferasa que es esencial para la cohesión de cromátidas hermanas 21,22. Se acetila cohesinas en la porción del anillo SMC3 estabilizando así cohesinas para asegurar correcta segregación cromosómica en la metafase-anafase transición 23. La pérdida de ESCO2 en el pez cebra lleva a chmissegregation romosome, hermana prematura separación de cromátidas, la inestabilidad genómica, y dependiente de p53 y la apoptosis independiente 24,25. Debido a la disponibilidad, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 pez cebra mutante (en lo sucesivo, aurB m / my ESCO2 m / m, respectivamente) se utilizará para ilustrar esta técnica 25-27. Acoplamiento microscopía confocal con maquinaria de la célula fluorescente-tagged ha permitido a los investigadores visualizar dinámica de la cromatina y la membrana celular durante la mitosis 25,28,29. histonas-fluorescentes etiquetadas históricamente se han utilizado para visualizar la cromatina. Las histonas son proteínas nucleares compuestas de cuatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, y H4) que son responsables de la estructura del nucleosoma que compone los cromosomas 30. Mientras H2B es sin duda el más utilizado para la histona proteínas fluorescentes enel ratón y el cultivo celular, el uso de la histona 2A, Z Familia (H2A.F / Z) ha demostrado también para su uso en el pez cebra 31,32. Concanavalina A y la caseína quinasa 1-gamma por ejemplo, localizar a la membrana celular y se han demostrado eficaces en la visualización de la membrana celular en erizos de mar y Drosophila 33,34. Otros estudios han demostrado que la proteína fluorescente de etiquetado CAAX etiquetas de la membrana celular y tuvo éxito en el pez cebra 31. CAAX es un motivo que es reconocido por las enzimas de modificación post-traduccionales tales como farnesyltransferases y geranylgeranyltransferases. Las modificaciones de estas enzimas causan las proteínas a ser asociada a la membrana, por lo tanto etiquetar la membrana celular 35. Debido a la utilización anterior en el pez cebra, este protocolo eligió utilizar H2A.F / Z y CAAX para etiquetar la cromatina y la membrana celular. La aplicación de este método permitirá que el investigador para supervisar la mitosis en el nivel de célula individual para observar cromosoma individuodinámicas, como se monitorean así como simultáneamente múltiples divisiones celulares que pueden impactar en la diferenciación de tejidos y el desarrollo. Este artículo se centrará en la formación de imágenes de la dinámica de la segregación de cromosomas durante la mitosis en el nivel de células individuales. Dentro de este manuscrito, la capacidad de observar varias divisiones mitóticas, calcular el tiempo de división, y descifrar los fenotipos mitóticas se ilustra y se describe. Mediante el uso de estos parámetros, fisiológicamente relevantes de datos pueden ser recogidos y aplicados a varios estados de enfermedad afectados por defectos mitótico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

La mitosis es fundamental para el crecimiento y la diferenciación del organismo. El proceso es altamente dinámico y requiere ordenó eventos para llevar a cabo la condensación de la cromatina adecuada, la unión a microtúbulos del cinetocoro, la segregación de cromosomas, y la citocinesis en un marco de tiempo pequeño. Los errores en el delicado proceso puede dar lugar a enfermedades humanas, incluyendo defectos congénitos y cáncer. Los enfoques tradicionales que investigan estados de enfermedad mitótico humanos a menudo se basan en los sistemas de cultivo de células, que carecen de la fisiología natural y contexto de desarrollo / específico de tejido ventajoso en el estudio de enfermedades humanas. Este protocolo supera muchos obstáculos proporcionando una manera de visualizar, con alta resolución, dinámica de los cromosomas en un sistema de vertebrados, el pez cebra. Este protocolo se detallará un enfoque que puede ser utilizado para obtener imágenes dinámicas de células en división, que incluyen: la transcripción in vitro, la cría de pez cebra / recepción, la incrustación de embriones, y la imagen de lapso de tiempo. Optimización y modificaciones de este protocolo también se exploran. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas de la cromatina) y mCherry-CAAX (etiquetas de membrana celular) embriones de ARNm de inyección, la mitosis en AB de tipo salvaje, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 se visualiza pez cebra mutante. Alta resolución de imágenes en vivo en el pez cebra permite observar mitosis múltiples para cuantificar estadísticamente defectos mitótico y el momento de la progresión mitótico. Además, se observó la observación de aspectos cualitativos que definen los procesos indebidos mitótico (es decir, defectos congression, missegregation de cromosomas, etc.) y los resultados cromosómicas inadecuada (es decir, la aneuploidía, poliploidía, micronúcleos, etc.). Este ensayo se puede aplicar a la observación de tejido diferenciación / desarrollo y es susceptible al uso del pez cebra mutante y agentes farmacológicos. La visualización de cómo los defectos en la mitosis conducen al cáncer y los trastornos del desarrollo será de granmejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad.

La Figura 2 demuestra la capacidad de observar muchas divisiones celulares utilizando un campo de visión amplia de un tipo salvaje de cola de pez cebra AB. Más de siete células mitóticas se crean imágenes en un marco de tiempo de 14 min (Película 1). Dentro del transcurso de tiempo de dos horas, se capturaron más de 40 eventos de la mitosis. En promedio, se observaron 50 células en división en el AB y 30 células que se dividen en aur B...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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11.9K vistas.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...