Bölüm 1: TRIzol Reaktif kullanarak Total RNA ekstraksiyonu RNA ile çalışırken RNAses serbest olduğu bir ortamda çalışmak çok önemlidir. Sadece RNA prosedürleri ile kullanım için ayrılmış pipetler ve prosedürü başlamadan önce bir dekontaminant reaktif (örneğin, RNAse Uzakta) ile çalışma alanı püskürtme gibi basit önlemler çok yararlı. <ol><li> 1,5 ml mikrofuge&#39;de tüpünde RNA havuzu 50 zebrafish embriyoların yeterli miktarda elde etmek ve bir pipet ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak için. </li><li> Hemen TRIzol reaktif 1 250 ul embriyoları içeren mikrofuge&#39;de tüp ekleyin. TRIzol reaktif fenol içerir ve sadece davlumbaz altında kullanılmalıdır. </li><li> Pelet havaneli (yaklaşık 20 vuruş) ile embriyoların doku yeterince bozulur kadar Lyse ve homojenize. </li><li> Hücreleri yeterince homojenize zaman eşit, toplam hacim 1 ml 750 ul TRIzol reaktif ekleyin. </li><li> Nükleoprotein kompleksleri tam ayrılma izni için homojenize edilmiş örnekleri, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bu aşamada, örnek flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ya da protokol devam edilebilir saklanan olabilir. </li><li> 0.2 ml kloroform devam edecek ve 15 saniye karıştırın tüp rock. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika sonra 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de santrifüj 4 örnek inkübe ve ° C. </li><li> Karışım daha düşük bir kırmızı fenol-kloroform fazı, interfaz ve renksiz bir üst sulu faz ayırmak. Üst sulu faz RNA içerir. TRIzol (yaklaşık 0,6 ml) ilk hacminin yaklaşık% 60 üst tabaka oluşur. Interfaz tabakanın herhangi bir transfer için değil dikkatli olmak 1 ml pipet kullanarak yeni bir mikrofuge&#39;de tüpe üst sulu tabaka aktarın. </li><li> RNA 0.5 ml izopropanol eklemek çöktürmek için. </li><li> İzin örnek oda sıcaklığında 10 dakika oturup sonra 4 az 10 dakika 12.000 xg&#39;de örnek santrifüj ° C. RNA tüpün altındaki bir jel gibi pelet oluşturacaktır. </li><li> Pelet rahatsız olmadan, bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve 1 ml% 75 etanol pelet yıkayın. 4, 5 dakika boyunca 7.500 xg&#39;de hafifçe çevirerek ve santrifüj örnek karıştırın ° C </li><li> Santrifüj sonra, bir pipet ile etanol kaldırmak ve 10 dakika için ters örnek kurumasını bekleyin. </li><li> 100 ul RNAse ücretsiz su ekleyerek pelletini tekrar ve örnek inkübe 55 ° C&#39;de 10 dakika. Bu RNA rehidrasyon yardımcı olmak üzere kuluçka sırasında sık sık vorteks parmak tavsiye edilir. İsterseniz, örnek nitelik ve nicelik NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanarak kontrol edebilirsiniz ya da doğrudan bir sonraki adıma geçin. </li></ol> Bölüm 2: Qiagen RNEasy Mini Kit kullanılarak RNA Temizleme Qiagen RNEasy Mini Kit 2, diğer yöntemlerle izole bir RNA örnek kirleticiler ve kirleri giderilmesinde yararlıdır . Bu işlem için, β-merkaptoetanol, etanol ve nükleaz ücretsiz su Set içinde yer alan bileşenlere ek olarak ihtiyaç vardır. Bu işlem sırasında, isteğe bağlı bir DNAz tedavi tavsiye edilir. <ol><li> Kitinin ilk kullanımdan sonra, Tampon RPE Tampon RPE 1 hacim% 100 etanol 4 cilt ekleyerek hazırlıklı olmak gerekir. </li><li> Tampon RLT prosedürü gün taze olarak hazırlanması gerekecektir. Tampon RLT gerekli olacak toplam tutarı hesaplayın. Numune başına 350 ul bir hacim gereklidir. Tampon RLT hazırlamak için, her 1 ml tampon için β-mercaptoethanol 10 ul ekleyin. Bu davlumbaz altında yapılmalıdır. </li><li> Her bir numune için 350 Tampon RLT ul ve% 100 etanol 250 ul ekleyin. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme iyi karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de 2 ml toplama tüpü ve santrifüj yerleştirilen bir RNEasy sütuna, yaklaşık 700 ul örnek aktarın. </li><li> Santrifüj sonra, üzerinden akış atmak ve Tampon RW1 700 ul RNEasy bir spin kolon eklemek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de örnek Santrifüj ve sonra akış atmak. </li><li> DNAz Qiagen RNAse-Alerjik DNAz Kiti ile tedavi: DNAz tedavi isteğe bağlıdır ancak son derece yüksek kalitede örnekleri için tavsiye edilir. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> DNAz tedavi kiti ilk aldığınızda, DNAz 550 ul nükleaz içermeyen su ekleyerek DNAz I stok solüsyonu hazırlamak için ihtiyacınız olacak. Evirerek yavaşça karıştırın ve vorteks yok. Tek kullanımlık flakon içine 10 ul stok solüsyonu içeren kısım. , 9 aya kadar -20 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayabilirsiniz. Çözülmüş alikotları 4 ° C&#39;de 6 hafta için gerekirse saklanabilir, ancak çözülme sonra alikotları dondurursam yok. </li><li> DNAz I inkübasyon karışımı hazırlamak için, 10 ul DNAz I s RDD 70 ul Tampon eklemekörnek başına tak çözüm. Yavaşça tersine çevirerek karıştırın ve santrifüj tüpüne kısaca rezidüel sıvı formda tüp taraf toplamak için. Doğrudan RNEasy spin kolon 80 ul DNAz I inkübasyon karışımı ekleyin. DNAz tedavi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki DNAz tedavi oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon RW1 ekleyin. </li><li> Santrifüj yoluyla akışı atmak ve spin kolon 500 ul Tampon RPE ekledikten sonra. Örnek oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Santrifüj ve oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de örnek üzerinden akış atın. </li><li> 500 ul% 75 etanol santrifüj sonra spin kolon ekleyin. </li><li> 8.000 xg santrifüj yineleyin, ancak oda sıcaklığında 2 dakika boyunca. </li><li> Santrifüj yoluyla akışı atmak ve sütun 5 dakika kurumasını bekleyin sonra. </li><li> Hemen etanol izleri üzerinde herhangi bir sol kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 8.000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra transferi 1,5 ml yeni bir toplama tüpüne spin kolon ve 10 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe ve sonra oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg&#39;de santrifüj. RNA yoluyla akışı olacak. </li><li> Spin kolon başka bir 10 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Örnek oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonra çıkarın ve spin kolon silmek. RNA yoluyla akışı olacak. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ve kalitesini kontrol edin. </li><li> Buna ek olarak, denatüre jel çalıştırmak veya RNA bütünlüğünü denetlemek için bir Agilent 2100 bioanalyzer kullanın. </li><li> CDNA sentezi yapılabilir Örnekleri -80 ° C ye kadar saklanabilir. </li></ol> Bölüm 3: İlk Strand Invitrogen Üst Simge Sistemi kullanılarak cDNA Sentezi RNA kolayca bozulmasına neden RNAses tarafından bölünme eğilimli. Bunun sonucunda birçok gen ekspresyonu protokolleri doğrudan RNA sentezlenir olmuştur daha istikrarlı cDNA bir ürünü kullanmak için geliştirilmiştir. Invitrogen Üst Simge İlk Strand Sentez Sistemi 3 kullanarak ilk iplikçik cDNA burada ayrıntılarıyla sentezi. Her cDNA sentezi reaksiyonu, RNA&#39;nın 5 mg kadar hizmet verebilir. <ol><li> Prosedürü karışımı başlamadan önce ve her bir bileşenin kısaca santrifüj. </li><li> Tablo 1&#39;de belirtildiği gibi 0,5 ml steril bir mikrofuge&#39;de tüp RNA / astar karışım hazırlayın. </li><li> Örnek 65 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Hemen 10 dakika boyunca buz bulamaç örnek aktarın. </li><li> Örnek Tablo 2&#39;de belirtilen bileşenleri ile bir ana karışımı hazırlamak soğutma iken. Miktarlar 1 reaksiyon başına listelenmiştir. Buna göre reaksiyon toplam sayısı için hacimleri ayarlayın. </li><li> Soğuduktan sonra, 9 ul 5. adımda her RNA / astar karışımı hazırlanan master karışımı ekleyin. Yavaşça karıştırın ve kısa süreli santrifüj toplamak. Her numunenin toplam hacmi 19 ul olmalıdır. </li><li> Örnek bir termalcycler 2 dakika 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 ul Üst Simge II RT (50 adet), her tüp karışımı, 42 inkübe ° C de 60 dakika bir termalcycler. </li><li> 70 reaksiyon sonlandırın sonra ° C ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;ye kadar chill örnek PCR 8 ve 9 adımları için programlanmış olabilir. </li><li> Örnek 4 ° C ulaştıktan sonra, bir buz banyosunda reaksiyon aktarın. </li><li> Buz üzerinde her tüpe 1 RNAse H ul eklemek ve 37 az 20 dakika boyunca inkübe ° C Toplam hacmi 21 ul. RNAse H örnek eklenmesi RNA aşağılamak ve sadece tek iplikçik cDNA ürün bırakacaktır. </li></ol> Bölüm 4: cDNA İzolasyon ve Yağış <ol><li> 1,5 ml faz kilidi jel tüpü cDNA ürün izolasyonu kullanılır. 2 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de santrifüj 1,5 ml faz kilidi jel tüpü hazırlayın. Jel tüpün alt kısmında olmalıdır. </li><li> (21 ul), (Tris-doymuş pH 8.0 tamponlu) 81.5 ul fenol 24:1 kloroform izoamil alkol 81.5 ul ve örnek faz kilidi jel tüpü içine ekleyin. Birkaç kez yavaşça tersine çevirerek karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> CDNA üst sulu faz olmalıdır. Üst faz temiz bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp içine aktarın. Toplam hacmi 20 ul civarında olmalıdır. </li><li> 3 M NaOAc, pH 5.2 1X hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Örneğin üst sulu faz hacminin 20 ul eşit ise, 3 M NaOAc, pH 5.2 2 ul eklemek gerekecektir. </li><li> 5 mg / ml glikojen 7 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 1X hacim izopropanol ekleyin ve hafifçe karıştırın. Genellikle bu yaklaşık 30 ul izopropanol. </li><li> Örnek oda ısısı inkübe izin versonra 10 dakika boyunca e ve oda sıcaklığında 20 dakika 12.000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Tüpün alt kısmında küçük bir cDNA pelet oluşturmalıdır. Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice çıkarın. </li><li> % 70 etanol ve tersine çevirerek karıştırın 500 ul ekleyin. </li><li> Örnek 5 dakika 12.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve% 70 etanol yıkama ve santrifüj (10 ve 11. adımları) tekrarlayın sonra. </li><li> Santrifüj sonra bir pipetle süpernatant çıkarın. Tüp tarafta kalan sıvı varsa, kısaca tüp iplik elde edilebilir. Herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve pelet 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Pelet rehidrate 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. Pelet rehidrasyon için 5 dakika süreyle 55 ° C&#39;de örnek yerleştirin. </li><li> CDNA ürün miktarı ve kalitesi daha sonra üreticinin talimatlarına aşağıdaki NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak kontrol edilir. CDNA -20 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar RNA temizleme sonra, yüksek kalitede toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram 50 zebrafish embriyolardan beklenebilir. Toplam RNA kalite, spektrofotometre, jel elektroforezi, ve bir Agilent 2100 Bioanalyzer değerlendirmek için kullanılabilir. NanoDrop ND-1000 spektrofotometre, 260 nm&#39;de absorbans 280 nm (Şekil 1) absorbans karşılaştırma değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 oranı bulaşanların varlığının ortaya çıkarmak ve olası bir bozulma kanıt verebilir. Bir A 260 / A 280 oranı 1,9-2,0 arasında kabul edilir. Buna ek olarak, yüksek bir RNA denatürasyon jel RNA bütünlüğünü değerlendirmek için çalışılması tavsiye edilir. RNA ipliklerini jel küçük iplikçikler daha aşağı göç eden, onların büyüklük bazında ayrı olacaktır. Uğramamış bir örnek, iki güçlü bantları ile bir karalama olarak görünecektir. Smear, farklı büyüklükte mRNA ipliklerini bir nüfusun bir sonucudur ve bantları 28S ve 18S rRNA karşılık. 28S grup 18S bantlı (Şekil 2) olarak yaklaşık iki kat daha yoğun olmalıdır. Alternatif olarak, toplam RNA bütünlüğünü Agilent 2100 bioanalyzer kullanarak tespit edilebilir. 28S ve 18S rRNA temsil eden iki ayrı doruklarına beklenmektedir (Şekil 3). 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır. İki farklı zirveleri bozulmuş örneklerde gözlenen olmayacaktır. RNA örnekleri sergileyerek bozulması sonraki deneysel prosedürleri ile yapılmamalıdır. Spektrofotometrik analiz (Şekil 4) cDNA ürün kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA&#39;nın 5 mikrogram bir giriş ile cDNA reaksiyonlar laboratuvarda rutin olarak 1-2 mg cDNA ürün verir. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. RNA örnek NanoDrop spektrumu. RNA temizleme sonra, RNA miktarı ve kalitesi NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilmiştir olabilir. Yüksek kalite toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram rutin 1,9-2,0 civarında bir A 260 / A 280 oranı ile 50 zebrafish embriyolar vermiştir. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bir RNA denatürasyon jel toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek için, bir RNA denatürasyon jel koştu olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki parlak bantlar ile smear bekleniyor. 28S grup 18S bantlı olarak yoğun olarak yaklaşık iki katı olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek bir bioanalyzer. RNA örnek bir iz, örnekleri de bir Agilent 2100 bioanalyzer analiz olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki sivri tepeler, görünür olmalıdır. 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. CDNA bir örnek NanoDrop spektrumlu bir NanoDrop ND-1000 ile Spektrofotometrik analiz cDNA ürünün miktarı ve kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 oranı 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA 5 ug bir giriş ile cDNA reaksiyonlar rutin laboratuvarda cDNA 1-2 ug verim. Tablo 1 Bileşenleri, cDNA sentezi 2. adım, RNA / astar karışımları için eklemek için. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Toplam RNA (5 mg) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / ml) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC-arıtılmış su </td><td> n ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2. cDNA sentezi 5. adım Reaksiyon karışımı. Listelenen Hacimler tepki başına. Reaksiyon toplam sayısı için her bileşen hacimleri artırın. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 0.1 mM DTT </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RNA molekülü kırılganlık bu protokolü boyunca hatırlanması gereken gereken en önemli husustur. RNAse-ücretsiz steril laboratuvar RNAse serbest bölge her zaman kullanılmalıdır. Sadece RNA işlemleri için kullanılacak laboratuvar bir bölümünü ayırmak için yararlı olur. Bu alan, sık sık Away gibi RNAse RNAse kaldırarak ürün, püskürtülmüş olmalıdır. RNA örnekleri her zaman eldiven ile ele almış ve bozulmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. <p class="jove_...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Birçok önemli ve karmaşık laboratuvar işlemleri, yüksek kaliteli, sağlam RNA bir giriş gerektirir. Bozulmuş bir örnek veya yabancı maddelerin varlığı downstream deneysel uygulamalar felaket sonuçlarına yol açabilir. , Bu nedenle üstün bir örnek sağlamak için çok sayıda güvence ve kalite kontrol katı tekniklerini kullanmak için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz detay izleri ticari bir RNA izolasyon kiti kullanılarak DNA ve kirleri çıkarmak için, piyasada yaygın olarak bulunan kimyasal denaturant ve daha sonraki temizleme kullanarak tüm zebrafish embriyolar toplam RNA izole etmek için bir protokol. RNA nispeten istikrarsız ve RNAses tarafından bölünme kolayca eğilimli olduğu gibi, çoğu protokolleri tahlil gen ekspresyon doğrudan bir RNA sentezlenir bir cDNA ürün. Biz, ayrıntılı bir prosedür RNA ticari kiti kullanılarak, daha istikrarlı bir cDNA ürün haline dönüştürmek için. Bu işlemler boyunca örnek bozulmuş veya kontamine olmadığından emin olmak için birçok kalite kontrol vardır. Mikroarray analizi, RT-PCR veya uzun süreli depolama için uygun olup olmadığını bu protokollerin son ürün cDNA.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis at JoVE.com

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Yüksek kalitede izolasyonu, RNA bozulmamış birçok laboratuar protokolleri önemli bir adımdır. Burada, bütün zebrafish embriyolar ve gen ekspresyon mikrodizi analizi de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürleri müteakip uygulama için cDNA sentezi RNA ekstraksiyon göstermektedir.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K Görüntüleme.  Purdue University. Yüksek kalitede izolasyonu, RNA bozulmamış birçok laboratuar protokolleri önemli bir adımdır. Burada, bütün zebrafish embriyolar ve gen ekspresyon mikrodizi analizi de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürleri müteakip uygulama için cDNA sentezi RNA ekstraksiyon göstermektedir.

Video: RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...