Samir Hamdan ayudó en el desarrollo de esta técnica. E. proteínas coli son del laboratorio del profesor Nick Diaz, las proteínas de la Universidad de Wollongong, y T7 son del Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. El trabajo es financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM077248 a amvo) y la Fundación Jane Coffin Niños (JJL).

Antes de realizar un experimento de replicación de una sola molécula, unos pocos tienen que estar preparados de antemano. 1. Patrón de ADN de replicación El sustrato para la reacción de replicación es un biotina, cola M13 círculo rodante prepararse con técnicas de biología molecular 1,2. Materiales: M13mp18 ADN de cadena sencilla, primer oligonucleótido biotinilado cola (5&#39;-biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), ADN polimerasa T7, bloque de calor, el alcohol fenol / isoamílico / cloroformo <ol><li> Recocer la cola oligo biotinilado a la M13 por la adición de un exceso de 10 veces de oligo en tampón TBS (330 nM cola oligo, 33 nM M13). </li><li> Calentar la mezcla a 65 ° C en el bloque de calor. Una vez caliente, a su vez el bloque de calor y deje un enfriamiento lento para templar correctamente la cartilla. </li><li> Agregue el M13 preparado para una mezcla de 64 nm de la polimerasa T7 ADN y la replicación T7 tampón que contiene dNTPs y MgCl 2. </li><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 12 minutos y apagar con 100 mM EDTA. </li><li> Purificar el lleno-en el ADN de productos con la extracción de alcohol de fenol / cloroformo / isoamílico y diálisis en buffer TE o tampón otro dispositivo de almacenamiento adecuado y determinar la concentración de ADN (Back-extracto de cada fase orgánica para recuperar los residuos preparados M13). </li><li> Una repetición de la preparación de la plantilla puede hacer fácilmente varios mililitros de la plantilla de concentración nanomolar, suficiente para cientos de miles de experimentos de una sola molécula. </li></ol> 2. Cubreobjetos funcionalizados Para unir el ADN a la cubreobjetos de vidrio, el vidrio es el primer funcionalizados con un aminosilano, que se acopla a las moléculas de PEG con biotina. Esta capa ayuda a reducir las interacciones no específicas de ADN y las proteínas de replicación con la superficie de 1,3. Materiales: cubreobjetos de vidrio, cubetas, 3-aminopropiltrietoxisilano, éster de metoxi-PEG5k-NHS, biotina-PEG5k NHSester, acetona, KOH 1M, etanol, horno, baño de ultrasonido <ol><li> Limpiar a fondo el cubreobjetos de vidrio, colocándolas en la tinción de los frascos y llenar los frascos con etanol. Sonicar durante 30 minutos y enjuague los frascos y llenar con 1 M KOH. Sonicar durante 30 minutos Repita ambos lavados. </li><li> Para la reacción de funcionalización en primer lugar, todos los rastros de agua necesitan ser removidos. Llenad las tinajas de acetona y ultrasonidos durante 10 minutos. Enjuague los frascos una vez más con acetona. </li><li> Preparar un 2% v / v solución del reactivo de silano en acetona. Añadir a la cubetas y agitar durante 2 minutos. Esta reacción se acopla el grupo alcoxi de la aminosilano al vidrio, dejando una amina reactiva para la próxima etapa de acoplamiento. Detener la reacción con un gran exceso de agua. </li><li> Seque el cubreobjetos de hornearlas a 110 ° C en el horno durante 30 minutos. </li><li> Prepare una metoxi 50:1: biotina mezcla de PEG en 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Trate de alrededor del 0,2% w / v de PEG con biotina. </li><li> Pipetear 100 L de la mezcla de PEG en un portaobjetos seco silanizada y otro lugar cubreobjetos en la parte superior. Incluyendo un separador cubreobjetos permitirá la separación de las laminillas. </li><li> Incubar los cubreobjetos en la solución de PEG durante 3 horas, luego se separan cada par de cubreobjetos y lavar intensamente con agua. Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos funcionalizada hacia arriba, ya que sólo una vez que lado va a ser recubierto con PEG. </li><li> Seque el cubreobjetos y guardar al vacío. Las superficies se mantienen estables durante al menos un mes, por lo que decenas de cubreobjetos se puede hacer en un lote y se utiliza según sea necesario. </li></ol> Estos materiales deben ser hechas antes de tiempo, y luego se usa para cada experimento. Para iniciar cada experimento de una sola molécula, comience el montaje de la cámara de flujo. 3. Preparación de la Cámara de flujo El experimento se realiza con una cámara de flujo sencillo construido con un cubreobjetos funcionalizados, cinta de doble cara, una diapositiva de cuarzo y tubos. Una cámara de flujo se prepara para el 1,4 experimento cada molécula. Materiales: cinta de doble cara, una hoja de afeitar, diapositivas de cuarzo con agujeros para la tubería, de secado rápido epoxi, cubreobjetos funcionalizados (ver arriba), la solución de estreptavidina (25 l de 1 mg / ml en PBS), tubos, tampón de bloqueo (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml de BSA, 0,005% de Tween-20) <ol><li> Comience colocando 20-25 ml de tampón de bloqueo en un desecador para eliminar cualquier burbuja de aire para los pasos posteriores. </li><li> Tome un cubreobjetos PEG-funcionalizados y la propagación de la solución de estreptavidina 125 PBS diluido a lo largo de la superficie. Dejar esta tarea a incubar durante 20 minutos mientras se preparan otras partes de la cámara, permitiendo estreptavidina para unirse Biotins superficie. </li><li> Corte un pedazo de doble carad cinta que coincida con el tamaño de la diapositiva de cuarzo. Marque la posición de los orificios de la tubería en la cinta con un lápiz de modo que un esquema de la cámara de flujo se pueden extraer de la cinta (1 mg / ml). </li><li> Hacer una de 2 mm de ancho rectángulo alrededor de los agujeros. Esto servirá como canal de flujo, así que asegúrese de que los lados rectos y dejar espacio alrededor de la entrada y la salida de la tubería. Si lo desea, los canales múltiples o diferentes tamaños se pueden utilizar. </li><li> Corte a lo largo de la línea trazada, por lo que los cortes rectos y limpio para asegurarse de que no sobresale adhesivo en el canal. </li><li> Limpiar el cuarzo a fondo con acetona o etanol para quitar el adhesivo de la construcción de flujo de la celda anterior. </li><li> Encontrar la mejor alineación de las líneas de canal, eliminar una parte de la superficie adhesiva y colocar con cuidado la cinta en el portaobjetos de cuarzo. Tenga cuidado de alinear correctamente la cinta, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer bloqueados. </li><li> Cortar trozos de tubos para la entrada y salida de la celda de flujo. Que ayuda a cortar el extremo del tubo de aproximadamente un ángulo de 30 ° para que el tubo no se prensa plana contra el fondo de la cámara. Coloque los tubos en algún tipo de apoyo para suspender para la conexión fácil a la celda de flujo en los próximos pasos. </li><li> Enjuague el portaobjetos recubiertas de estreptavidina a fondo con agua y secar con aire comprimido. Recuerde que sólo un lado es funcionalizados, tenga cuidado de no convertir el cubreobjetos encima. Retire el otro lado del soporte de la cinta y colocar la placa de cuarzo en el cubreobjetos. </li><li> Presione suavemente el cubreobjetos para expulsar el aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a evitar las burbujas de aire en el canal de flujo. </li><li> Sello de los lados de la cámara con epoxy. Inserte la tubería cortada en los agujeros del cuarzo y el sello en su lugar con epoxy. Esto tiene que secar por unos minutos. </li><li> Una vez seca, comenzará a bloquear la superficie tirando algunos de los buffer desgasificar el bloqueo a través de uno de los tubos. Una aguja de calibre 21 encaja perfectamente dentro de la tubería de 0,76 mm. Ras un par de veces para eliminar las burbujas de aire, y permitir que la cámara de incubación por lo menos durante media hora. </li></ol> 4. Una sola molécula de replicación Experimento Materiales: cámara de flujo preparado, SYTOX Orange, microscopio TIRF, 532 nm láser, CCD de la cámara, ordenador con software de adquisición de imágenes, círculo rodante sustrato de ADN, las proteínas de replicación <ol><li> Después de la celda de flujo ha sido bloqueado, todo está listo para comenzar el experimento de una sola molécula. </li><li> Tome la celda de flujo y colocarlo en la platina del microscopio. Mantenga la cámara en su lugar con clips de la etapa y estar seguro de que el canal de flujo esté recto a lo largo del eje. </li><li> Conecte el tubo de salida de la celda de flujo de la bomba de jeringa con un tubo de diámetro de conector más grande o una aguja. Coloque la entrada en tampón de bloqueo y tire hacia atrás de la jeringa para eliminar el aire en el tubo. Un movimiento suave del tubo de salida va a ayudar a eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. </li><li> Diluir la plantilla de ADN de valores a 25 pM en 1 ml de tampón de bloqueo. Flujo en la cámara a una velocidad moderada para permitir el flujo de cobertura de la superficie buena de ADN. 0.025 ml / min durante 30 minutos funciona bien. Esto puede variar según el número de moléculas de ADN están en la superficie de cada lote de cubreobjetos o cuántos se desean para el experimento. </li><li> Una vez que el ADN se encuentra en, lavar el exceso de ADN con el tampón de bloqueo. Lávese las manos por lo menos 200 células de flujo de los volúmenes de deshacerse de todo el ADN libre. </li><li> Comience desgasificación del búfer de duplicación. Para el E. experimentos coli la replicación, haga lo siguiente a 37 ° C para reducir el riesgo de burbujas en la cámara de flujo caliente. </li><li> Encienda el láser y la cámara. El CCD enfriado las necesidades para alcanzar la temperatura antes de que pueda ser utilizado. </li><li> Si se realiza a 37 ° C experimento, a su vez la calefacción. Asegúrese de que el objetivo está en contacto con la celda de flujo o será un disipador de calor más tarde. </li><li> Después de lavar y la desgasificación, la reacción puede ser preparado. Nucleótidos mezcla, la TDT, y SYTOX en el buffer de la replicación. A continuación, añadir proteínas y mezclar suavemente. </li><li> El flujo de la mezcla de reacción en la celda de flujo. Esta velocidad de flujo debe ser suficiente para estirar dsDNA. Para un niño de 2 mm de ancho, de 100 m de altura canal de flujo de 0,04 ml / min funciona bien. </li><li> Dé tiempo para que la mezcla entre en la cámara y comenzará a marcar. Un buen consejo es mover el campo de visión hacia el lado del canal y se centran en el material adhesivo. Esto asegurará que se encuentran cerca de la superficie para enfocar. </li><li> Ajustar la potencia del láser, el enfoque microscopio, y el ángulo TIRF. Mantener el bajo consumo de energía para evitar cualquier photocleavage del ADN de colores. Adquirir en 5.1 fotogramas / segundo durante varios minutos dependiendo de la tasa de replicación del ADN. Si lo desea, repita a ser más largas trayectorias de replicación o trasladarse a un nuevo campo para ver más moléculas. </li><li> Después de la mezcla de reacción está casi vacío, es una buena idea para el flujo de más de amortiguación con SYTOX para ver otros campos de la vista. Tomar varias imágenes de diferentes moléculas replicadas proporciona estadísticas para la determinación de procesividad. </li></ol> 5. Resultados representante Moléculas de replicación activa son fácilmente visibles como líneas de crecimiento de ADN manchado. En nuestros experimentos, que fluye 25 horas del sustrato M13 ofrece 100-1000 moléculas en un 60x, 125 m x 125 m de campo de vista (Figura 1). La realización de experimentos de replicación utilizando el E. proteínas coli replisoma a 37 ° C (ver Materiales para más detalles) le da réplica moléculas 50-50 por campo de visión. En concentraciones equivalentes de la replisoma T7, que inicia en el sustrato mucho más eficiente, se observa&gt; 70% de las moléculas en un campo de replicar. Estas condiciones producen una densidad del producto tan alto que las moléculas individuales son difíciles de resolver y analizar, de modo que los experimentos T7 se realizan en las concentraciones de proteína más bajos. Análisis de datos: Para obtener la velocidad de datos, simplemente trazar el punto final de la ADN en función del tiempo y calcular la pendiente (Figura 2). Para procesividad, determinar la longitud total del ADN. Ambos de estos números tendrán que convertirse en pares de bases. Antes de realizar el experimento, usted debe saber el tamaño en píxeles de la cámara en un aumento adecuado. Para la conversión de pares de bases, una buena estimación es simplemente la conversión sobre la base de la longitud de cristalografía de ADN, 2,9 pb / nm. Sin embargo, el flujo laminar completamente no se estira el ADN, por lo que la calibración de la longitud del ADN se debe realizar mediante la adopción de un ADN de longitud conocida, por ejemplo, 48.502 pares de bases del ADN λ, adjuntando a la celda de flujo con un oligo biotinilado y medir su SYTOX manchada de longitud en el caudal utilizado para el experimento de replicación. Determinar el número de pares de bases / pixel permite un cálculo exacto de las tasas de repetición y processivities. Tomar numerosas imágenes y películas se ofrecen un gran número de moléculas de producto, lo que permite el trazado de las distribuciones de frecuencia y procesividad (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (De Ref 1.) Una historieta) de la prueba de la replicación de círculo rodante. (SA, estreptavidina). Principal capítulo de síntesis se extiende la cola que une el círculo y la superficie. La cola se convierte en ADN de doble cadena por la polimerasa de cadena retrasada y se extendía por el flujo laminar. b) Ejemplo de campo de visión con SYTOX Orange y 532 nm de excitación. Pequeñas manchas fluorescentes están atados, no replicado sustratos. Tenga en cuenta la eslora máxima de los productos y el gran número de productos por campo (cada celda de flujo contiene&gt; 5,000 campos de este tipo). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adaptado de la Ref 1). A, b) Kymographs típica de las moléculas de la replicación del T7 (a) y E. coli (b) los experimentos. c) las trayectorias de extremos de las moléculas de a) y b) trazado en función del tiempo. Trayectorias están equipados con la regresión lineal para obtener las tasas de replicación. Ejemplos que se muestran son 99,4 pb s -1 y 467,1 pb s -1. d) Duración de la distribución de los productos de replicación, se ajustan a la decadencia exponencial simple para obtener procesividad: 25,3 ± 1,7 kpb (T7), 85,3 ± 6,1 kpb (E. coli). e) Tasa de las distribuciones de las trayectorias de una sola molécula, se ajustan a gaussianas sola. Medios: 75,9 ± 4,8 pb s -1 (T7), 535,5 ± 39 pb s -1 (E. coli).

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	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Un crítico de control es examinar el efecto de la mancha naranja, SYTOX, en la replicación de proteínas de interés. Una manera simple de hacer esto es llevar a cabo el experimento de replicación en la celda de flujo como se describe, pero con la omisión de SYTOX. Después de la mezcla de reacción ha fluido a través de la cámara, añadir tampón con SYTOX para teñir el ADN y examinar la distribución de la longitud de las moléculas de reproducirse. Por otra parte, las reacciones estándar a granel se pueden utilizar para comprobar ningún efecto sobre la tasa de SYTOX la replicación y la eficiencia. El experimento que se describe aquí sólo utiliza un canal de flujo único. Esto se puede cambiar fácilmente mediante la creación de canales múltiples cámaras de flujo o el uso de PDMS o similares dispositivos de microfluídica. Aumentar el número de canales facilita en gran medida de detección de las concentraciones de proteínas, mutantes, o moléculas inhibidoras y aumenta la rapidez de la replicación de recolección de datos. Como se ha mencionado, se realiza la E. experimentos coli la replicación a 37 ° C con una casa construida de aluminio calentador de flujo de células, un elemento de calefacción resistivo (calentador de cartucho) y fuente de alimentación variable. Esto le da estabilidad a la temperatura buena y evita la compra de un calentador de objetivo. Para calibrar la calefacción, simplemente un agujero en el centro de un importante flujo de celda de cuarzo, insertó un termopar en el canal de flujo y fluido de amortiguación de forma normal. La medición de la temperatura de la celda de flujo de amortiguación a tensiones cada vez permite un calentamiento preciso.

Replicación T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, cloruro de magnesio 10 mM, 100 mg / ml BSA, con 5 mM de ditiotreitol, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 M CTP y 15 nM SYTOX naranja añadido inmediatamente antes de uso. Proteínas añadidas como: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM de la polimerasa (1:1 GP5: tiorredoxina), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli replicación: HEPES 50 mM pH 7,9, 12 mM de acetato de magnesio, cloruro de potasio 80 mM, 100 ug / ml de BSA con mM ditiotreitol 10, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs M, y 15 nM SYTOX naranja añadido inmediatamente antes del uso. Proteínas añadidas como: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monómero), 30 nM αεθ, 15 nM τ γ 2 1 δδ&#39;χψ o τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dímero), 300 nM dnaG, 250 nM SSB (tetrámero), 20 nM Pría, 40 nM PriB, 320 nM Pric, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Se describe un simple microscopía de fluorescencia basada en tiempo real el método para la observación de la replicación del ADN en el ámbito de una sola molécula. Una plantilla circular, ADN horquilla se une a un cubreobjetos funcionalizados y reproducido ampliamente después de la introducción de las proteínas de replicación y los nucleótidos (Figura 1). Los productos de mayor crecimiento de doble cadena de ADN (dsDNA) se amplía con flujo laminar y se visualizan mediante el uso de un colorante intercalante. La medición de la posición del extremo del ADN que crecen en tiempo real permite la determinación precisa de la tasa de replicación (Figura 2). Además, la duración de los productos de ADN completó los informes sobre la procesividad de la replicación. Este experimento se puede realizar con mucha facilidad y rapidez, y sólo requiere un microscopio de fluorescencia con una cámara bastante sensible.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.3K vistas.  Harvard Medical School. Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Investigación

Biología

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos