Nos gustaría agradecer al Dr. Cashdollar Bill por su apoyo en el uso de la citometría de flujo básico.

<ol><li> Antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Hielo </li><li> Tubos de 15 ml cónicos de tinción de las células y de 12 x 75 mm tubos de flujo para la tinción de los controles de un solo color. </li><li> Tinción de amortiguación: tampón fosfato salino (PBS) + 3% de suero fetal bovino (FCS) </li><li> Pipetas </li><li> Fc bloque (si es necesario) y los anticuerpos tinción. Anticuerpos necesidad de ser valorados para la tinción óptima. </li><li> Cuentas de compensación </li><li> Amortiguación de la suspensión: solución salina equilibrada de Hank (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% de FCS </li><li> Azul de tripano y hemocitómetro </li><li> Células colador (40 m de nylon) </li><li> Tubos de recogida: Hay dos tipos de tubos de recolección se puede utilizar a) 12 x 75 mm tubos de poliestireno (que contiene 300 l FCS y HEPES 25 mM) o b) tubos de 15 ml cónicos (que contiene 1 ml de FCS + HEPES 25 mM). Cualquier medio rico con la concentración sérica alta se puede utilizar para la recolección de células seleccionadas. </li></ol></li><li> Generar una suspensión de células individuales de la población de células de partida. </li><li> Opcional: para enriquecer la población celular deseada por un método de purificación a granel, tales como el agotamiento de complementar o clasificación magnética. La principal ventaja de la etapa de enriquecimiento es que reduce el tiempo de clase. </li><li> Lave las células una vez con buffer de tinción. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en buffer de tinción en una concentración de hasta 50 x 10 6 para la tinción eficiente. </li><li> Opcional: Para las células que expresan altos niveles de FcR, bloquean los receptores con un método apropiado de bloqueo. Un método de elección es el uso de un mAb que se une a FcγR en hielo durante 10-15 min. Estos anticuerpos se encuentran disponibles comercialmente. </li><li> Añada la MAB (a una concentración predeterminada) para teñir la población celular deseada e incubar durante 20-30 minutos sobre el hielo en la oscuridad, seguido de dos lavados con buffer de tinción. Opcional: La tinción con un colorante vital, como el yoduro de propidio, se pueden incluir para distinguir las células muertas (5). Si multi-color de tinción se va a utilizar, los controles de un solo color son obligatorios. Usamos CompBeads BD para preparar los controles de un solo color con el protocolo del fabricante. </li><li> Si no se utiliza directamente los anticuerpos conjugados, repita el paso 7, utilizando el anticuerpo secundaria apropiada o conjugado estreptavidina. </li><li> Después del lavado, resuspender las células en medio de cultivo y determinar la concentración de células usando un colorante vital como el azul tripán. </li><li> Ajustar la concentración de células a 15-20 x 10 6 / ml. Para las poblaciones de células que forman grupos, que pueden obstruir el instrumento durante la clasificación, el filtro de las células a través de un colador. </li><li> Configurar y optimizar el clasificador de células. El proceso de creación de un citómetro de flujo es muy variada dependiendo de la fabricación y debe ser realizada por personal debidamente capacitado. Las recomendaciones generales son las siguientes: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Seleccione la boquilla adecuada dependiendo del tipo de célula para realizar la clasificación. </li><li> Para las clases estériles, esterilizar el instrumento. </li><li> Realizar el control de instrumentos de calidad con cuentas para verificar los láseres están funcionando, y es clasificar con precisión. </li><li> Instalar el dispositivo de recogida necesarios y establecer las corrientes laterales. </li><li> Mira láser del instrumento y detector establecida para la determinación de las etiquetas fluorescentes que se pueden utilizar (nuestra BD FACS Aria dispone de tres láseres y puede detectar hasta nueve colores). </li><li> Una vez que se determina lo que las etiquetas fluorescentes se utilizan en el clasificador de células, la compensación puede llevarse a cabo (como se explica más adelante). </li></ol></li><li> Realizar la compensación con la muestra de control negativo y los controles positivos solo. La compensación es necesaria para eliminar la superposición de espectro entre los dos detectores. Es pertinente señalar que la indemnización no es a toda prueba y se ve afectada por el brillo con marcadores de ciertas manchas, y por la fluorescencia de las células que han autofluorescencia bajo, lo que puede conducir a la resolución entre las poblaciones pobres oscuro y negativo. Para mejores resultados, el diseño experimental debe incluir el uso de fluorocromos brillante con marcas que tienen una expresión baja o que no tienen un patrón de tinción conocido. Marcadores que proporcionan una buena separación entre las poblaciones de células y son altamente expresado debe ser utilizado con fluorocromos como el dímero excitado por los rayos láser de color rojo o violeta. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> La compensación puede ser realizada con cuentas de compensación, que son micropartículas de poliestireno que se han unido a un anticuerpo específico para la cadena ligera Kappa de Ig de ratón, la rata o ratón / hamster. Las cuentas son fáciles de mancha, tienen una potente señal y proporcionar una manera fácil de preparar un solo control que han manchado el fluoróforo igual que las muestras experimentales. </li><li> Configurar una plantilla que incluye una parcela para mostrar dos variables de dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC), y el histograma de unacada fluorocromo que se utilizará. </li><li> Ejecute el tubo de control negativo y ajustar la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para colocar a la población de interés en la escala. </li><li> Ajustar la configuración del PMT de fluorescencia para colocar el negativo de la población o autofluorescencia en la parte de la extrema izquierda del histograma. </li><li> Registre el tubo de control negativo. </li><li> Ejecutar los tubos de una sola positiva controlar y registrar los datos de cada tubo. </li><li> Dibuja una puerta de intervalo alrededor de la parte positiva de los datos en el histograma, y ​​otra puerta de intervalo en la parte negativa del histograma. </li><li> Compensación manual se realiza mediante el ajuste de la mediana (la mediana es una mejor estimación de la tendencia central que la media en una escala logarítmica) de los positivos hasta que sea igual a la mediana de los negativos. Esto debe hacerse para cada una de las etiquetas fluorocromo utilizado en el experimento. </li><li> Para ajustar la mediana, ajustar los valores de solapamiento espectral superior o inferior hasta las medianas para cada partido de parámetros fluorescentes de la medida de lo posible. </li><li> La compensación también se puede hacer automáticamente con el software de análisis. Compensación automática utiliza los datos registrados en los controles de compensación para el cálculo de una matriz algebraica de todos los fluoróforos utilizados en el experimento. Estos valores se utilizan para sustraer las contribuciones de los colores no primarios que están sangrando al detector de un color primario. </li></ol></li><li> Registro de la muestra experimental a ordenar y utilizar las herramientas y los métodos de gating subconjuntos para definir las poblaciones de interés. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Configurar la plantilla experimental con un gráfico de puntos que muestra FSC frente a SSC y el uso de una herramienta de activación de puertas, polígono, rectángulo, intervalo o cuadrante de la puerta de la población de interés. El diagrama de dispersión muestra las propiedades físicas de la célula que es distinto del tipo de células. </li><li> La mejor manera de determinar la estrategia de gating fluorescencia es el uso de la fluorescencia menos uno de control (FMO). En un tubo de control de FMO todos los reactivos que se utilizan en el experimento se incluyen a excepción de la que le interese. La FMO ayuda a discriminar entre las poblaciones con poca colores y amplia las poblaciones negativas. </li><li> Utilicen los datos registrados a partir de tubos de FMO para determinar dónde colocar compuertas en el tubo experimental. </li></ol></li><li> Una vez que las puertas se han determinado, las puertas pueden ser seleccionados para la clasificación en los tubos de recolección externa. Un máximo de cuatro puertas (o poblaciones) pueden ser ordenados en un momento en función de los instrumentos disponibles. </li><li> Ejecute el tubo de la muestra experimental a 4 ° C, a su vez en las placas de desviación, y ordenar la muestra. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 células se pueden clasificar en un tubo de 12 x 75 mm y 1,5 x 10 6 - 4.5 x 10 6 células se pueden clasificar en un matraz cónico de 15. </li><li> Una vez que el número necesario de células se ha obtenido, detener manualmente la clasificación. </li><li> Realizar un análisis post-tipo para determinar la pureza de las poblaciones de células ordenados. </li></ol> Los resultados representativos Hemos demostrado aquí los resultados de B de ratón esplénica y T CD4 clasificación de células (Figura 1). Esplenocitos fueron teñidas con PE Texas Red-conjugado anti-ratón B220, conjugado con FITC anti-ratón TCRβ y AlexaFluor-700-conjugado anti-ratón CD4 para identificar a las células B (B220 + TCRβ) y células T CD4 (CD4 + TCRβ + ). La clasificación se realizó con BD FACS Aria instrumento. Después de la clasificación de la pureza de las células B fue&gt; 97% y la pureza de células CD4 T era&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pureza de las células B del bazo y las células T CD4 después de FACS. Esplenocitos de ratón se tiñeron con B220 anti-ratón, TCRβ y anticuerpos CD4. FACS de las células B se realizó con un BD FACS Aria por gating en B220 + TCRβ las células (Fig. 1A, panel izquierdo, cuadrante inferior derecho). Un análisis de clase después se realizó para determinar la pureza de las células B (Fig. 1A, panel derecho). Tinción B220 se muestra en el eje X y la tinción TCRβ en el eje. FACS de las células T CD4 se realizó con el mismo citómetro de flujo por gating en TCRβ + células CD4 + (Fig. 1B, panel izquierdo, cuadrante superior derecho). Un análisis de clase después se realizó para determinar la pureza de las células T CD4 (Fig. 1B, panel derecho). Tinción TCRβ se muestra en el eje X y CD4 manchas en el eje. El porcentaje de células positivas en cada cuadrante se muestra. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La pureza de las células T CD4 esplénica después de FACS. Murino las células T del bazo fueron enriquecidos por la eliminación de las células B mediante los movimientos horizontales. Posteriormente, las células fueron teñidas con TCRβ ratón anti-CD4 y anticuerpos (panel izquierdo). FACS se realizó con un BD FACS Aria por gating en TCRβ + células CD4 + (panel de la izquierda, superior derecha Quadrant). Un análisis de clase después se realizó para determinar la pureza de las células T, que fue superior al 99% (panel derecho). Tinción TCRβ se muestra en el eje X y CD4 manchas en el eje. El porcentaje de células positivas en cada cuadrante se muestra. -&gt;

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FACS es una técnica altamente sofisticada para la purificación de las poblaciones celulares de interés, en la que puede ser una pureza muy alta (95-100%) de la población ordenados obtenidos. Por lo tanto, esta técnica es particularmente importante para los experimentos, donde los de alta pureza es un requisito esencial (por ejemplo, análisis de microarrays). FACS es particularmente ventajoso con respecto a otros métodos disponibles para la purificación, cuando una población de células necesita ser purificado basado en un marcador de superficie semanal expresa o cuando dos o más poblaciones necesitan ser purificados, que tienen diferentes niveles de expresión del marcador de la misma superficie. Por ejemplo, la purificación de la zona marginal de células B (B220 + CD21 hi CD23 int / bajo) y folicular de células B (B220 + CD21 int / bajo hi CD23) en base a los niveles de expresión de CD21 y CD23. Otra aplicación cada vez mayor de FACS es la clasificación de células individuales que permite el análisis de células individuales (3, 4). FACS también se utiliza comúnmente en las células que expresan proteínas fluorescentes tipo que son expresión genética, tales como las proteínas verdes fluorescentes de proteínas etiquetadas (5). Si una especie estéril se realiza de las células pueden ser cultivadas. Sin embargo, la viabilidad celular y el rendimiento puede verse comprometida durante la clasificación. Viabilidad se puede mejorar mediante el uso de una temperatura óptima dependiente de las células para la clasificación y procesamiento de los tubos de recogida inmediatamente después de alcanzar su capacidad. La recuperación puede ser mayor mediante el uso de tubos de polipropileno de recogida, la recolección de células ordenados en el suero de los medios de comunicación ricos y los tubos de recogida de invertir de forma intermitente, el mantenimiento de los tubos de recolección a una temperatura óptima y centrifugación las células ordenados por aproximadamente 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). El desarrollo de ultra alta velocidad clasificadores se ha extendido la posibilidad de la aplicación de la clasificación de flujo en el ámbito clínico. Las posibles aplicaciones clínicas de la FACS incluyen la purificación de las células madre de sangre de la sangre humana con fines terapéuticos, las aplicaciones en la terapia del cáncer, el reemplazo de la amniocentesis, la clasificación de esperma humano y la detección temprana de la enfermedad (6, 7). Para la tinción multicolor, la selección de anticuerpos es un paso crítico y fluorocromos son elegidos en base a que el sistema de detección para cada instrumento en particular. Hay un número de compañías que venden separadores de células, que pueden variar la configuración del láser de acuerdo con las necesidades del usuario. Así, uno no puede simplemente utilizar los anticuerpos exactamente el mismo utilizado en los estudios publicados sin confirmar la compatibilidad. Para la selección óptima de anticuerpos, se debe considerar el nivel de expresión de la proteína examinada. En general, la más brillante de los anticuerpos disponibles fluorocromo etiquetados deben utilizarse para teñir vagamente expresadas marcadores de superficie, mientras que fluorocromos débil puede ser utilizado para la tinción de los marcadores de superficie altamente expresado (8). Además, los anticuerpos deben ser seleccionados de tal manera que se superponen entre sus espectros de emisión es mínima. Para la tinción multicolor, es muy difícil elegir fluorocromo que no tienen ningún solapamiento espectral. En esta situación, la compensación se lleva a cabo. La compensación es necesaria para eliminar matemáticamente el solapamiento entre el espectro de fluorescencia de las emisiones de los fluorocromos distintos que es medible por los detectores (8-10). En otras palabras, la superposición de fluorescencia de un fluorocromo se resta del espectro de emisión de otro fluorocromo. El cálculo de la compensación requiere un control de manchas y solo los controles positivos para cada fluorocromo utilizado para la tinción multicolor (9, 10). La compensación puede llevarse a cabo utilizando células o glóbulos. Las cuentas son fáciles de mancha, tienen una potente señal y proporcionar una manera fácil de preparar un solo control que han manchado los fluoróforos igual que las muestras experimentales. Cuentas de compensación son especialmente ventajosas cuando la proteína de superficie celular de interés se expresa en un nivel bajo y cuando la población celular de interés es la limitación en la población de células de partida inicial. Una vez que los anticuerpos han sido elegidos, su actividad debe ser optimizado mediante la realización de un análisis de valoración. Esto es particularmente importante si la máquina ha FACS láser de gran potencia. El uso de concentraciones subóptimas de anticuerpos tinción puede resultar en la separación de los pobres de la población celular deseada de la población celular total. El uso de altas concentraciones de anticuerpos aumenta la probabilidad de antígeno de tinción no específica. Por lo tanto, valoración de anticuerpos que permiten la selección de la concentración de anticuerpos que le da el brillo máximo de la población positivos y tinción de fondo mínimos (8). FACS es actualmente una técnica estándar para la purificación de las subpoblaciones de células. Se puede utilizar para separar cualquier tipo de célula que puede ser una suspensión de células individuales y genera anticuerpos están disponibles para identificar la población celular deseada. FACS es el método de elección cuando highly poblaciones puras de células son obligatorios.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Los estudios experimentales y clínicos a menudo requieren altamente purificado poblaciones de células. FACS es una técnica de elección para purificar las poblaciones de células de fenotipo conocido. Otros métodos incluyen la mayor parte de la purificación panorama, el agotamiento del complemento y la separación de esferas magnéticas. Sin embargo, FACS tiene varias ventajas sobre otros métodos disponibles. FACS es el método preferido cuando de muy alta pureza de la población deseada es necesario, cuando la población de células diana expresa un nivel muy bajo de la marca de identificación o cuando las poblaciones de células requieren la separación basada en la densidad diferencial marcador. Además, FACS es la única técnica de purificación para aislar las células basadas en la tinción interna o la expresión de proteínas intracelulares, como un marcador de proteína modificada genéticamente fluorescente. FACS permite la purificación de las células individuales en función del tamaño, la granularidad y de fluorescencia. Con el fin de purificar las células de interés, que primero se tiñeron con fluorescente marcada con anticuerpos monoclonales (mAb), que reconocen los marcadores específicos de superficie en la población celular deseada (1). Selección negativa de células no teñidas también es posible. Purificación FACS requiere un citómetro de flujo con la clasificación de la capacidad y el software adecuado. Por FACS, células en suspensión se transmiten como un flujo de gotas de cada uno con una sola célula en frente de un láser. El sistema de detección de fluorescencia detecta las células de interés en base a parámetros predeterminados fluorescentes de las células. El instrumento se aplica una carga a la gota que contiene una célula de interés y un sistema de deflexión electrostática facilita la recolección de las gotitas cargadas en tubos de recogida adecuado (2). El éxito de la tinción y la clasificación por lo tanto depende en gran medida la selección de los marcadores de la identificación y la elección del MAB. Parámetros de clasificación se puede ajustar dependiendo de la exigencia de pureza y rendimiento. Aunque FACS requiere equipo especializado y la capacitación del personal, es el método de elección para el aislamiento de las poblaciones altamente purificada de células.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Para muchos estudios científicos que requieren un análisis biológico y químico de las poblaciones celulares de las células deben estar en un alto estado de pureza. Fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) es un método superior en el que para obtener poblaciones puras de células.

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K vistas.  BloodCenter of Wisconsin. Para muchos estudios científicos que requieren un análisis biológico y químico de las poblaciones celulares de las células deben estar en un alto estado de pureza. Fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) es un método superior en el que para obtener poblaciones puras de células.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...