La fotometría de fibra CSOM combina el indicador personalizado codificado genéticamente y las fibras ópticas para monitorear la actividad neuronal en animales que se mueven libremente. Lo cual es fundamental para entender cómo un grupo específico de neuronas juega en dirigir o responder a una acción o un estímulo. Esta técnica es una forma accesible de registrar desde regiones cerebrales específicas que se definen por su conexión o perfiles genéticos, con el control incorporado para separar la señal al ruido.
Demostrando que el procesador será, Ekaterina Martianova, una estudiante graduada en mi laboratorio. Comience aflojando todos los tornillos del traductor de cinco ejes. Atornille el cable de conexión al adaptador que se fija al traductor de cinco ejes.
A continuación, encienda la luz de excitación de 470 nanómetros a baja potencia y coloque la punta de la fibra apuntando a una diapositiva de plástico fluorescente automático. Siguiente grabación de la cámara CMOS o semiconductor de óxido metálico de cortesía en modo en vivo. Aumente la ganancia o ajuste la tabla de búsqueda hasta que la imagen sea visible en el punto focal del objetivo.
Avance el traductor de cinco ejes hacia el objetivo asegurando que la luz de 470 nanómetros se centre en la fibra en el extremo SMA o FC del cable de parche, hasta que una imagen se pueda resolver en la cámara. Por último, ajuste los ejes X e Y hasta que la imagen esté centrada y bien resuelta. Visualice la luz emitida desde el extremo variole del cable de conexión, ya que debería aparecer como un círculo isotrópico.
Comience encendiendo todas las luces de excitación para visualizar mejor las fibras. Y ajustar las ganancias de la cámara de tal manera que no hay píxeles saturados, y una imagen clara de las fibras están presentes. A continuación, tome una imagen preliminar.
Dibuja regiones de interés o ROIS alrededor de las fibras. Y manténgalos para la medición de los valores de intensidad media durante las grabaciones. Para múltiples grabaciones de fibra, pruebe para independientes mediante la grabación en vivo de todas las fibras.
Apunte una fibra hacia una fuente de luz y toque con un dedo. Observe las fluctuaciones en el canal. A continuación, aplique cinta adhesiva de color al extremo de las fibras para etiquetar qué ROI corresponde a qué fibra.
Por último, configure el área de grabación colgando el cable de conexión por encima de la arena utilizando soportes, abrazaderas y soportes. Por último, asegúrese de que el animal no estará limitado en movimiento por la longitud de la fibra y puede moverse libremente por toda la arena. Comience inspeccionando el extremo distal de las fibras del cordón de conexión por ojo y con un mini microscopio de fibra.
Si la superficie de las fibras está rayada, vuelva a pulir las fibras utilizando una película de pulido de fibra con grano fino. A continuación, limpie los extremos distales del cable de conexión con 70% de etanol y un aplicador de punta de algodón. Limpie las cánulas de fibra óptica con 70% de etanol y un aplicador de punta de algodón.
Conecte el extremo del variol del cable de conexión a la fibra implantada utilizando un manguito dividido de cerámica cubierto con un tubo retráctil negro. Durante la conexión, asegúrese de que el manguito esté apretado. Deje que el animal se recupere durante unos minutos.
A continuación, comience a grabar la señal óptica y ejecute el experimento. Durante la grabación, mantenga un ojo cuidadoso en el rastreo en vivo para asegurar grabaciones de calidad. Y esté atento a cualquier salto en la señal, lo que indica que la manga no está lo suficientemente apretada.
Para las grabaciones de doble color, agregue un LED de 516 nanómetros al sistema de fotometría para excitar el sensor de calcio fluorescente rojo, y los espejos y filtros dicroicos apropiados. A continuación, añada un divisor de imagen entre el objetivo y la cámara CMOS para separar las longitudes de onda de emisión verde y roja. Por último, dibuja ROIS alrededor de todas las fibras en ambos colores, rojo y verde.
Asegúrese de identificar claramente cada ROI con la fibra y el canal correspondientes. Acciona la excitación simultánea con 470 nanómetros y LED de 560 nanómetros, y los alterna con un LED de 410 nanómetros. Los resultados indican que la fluorescencia medida aumentó significativamente simultáneamente con la administración de soplos de aire para ratones con activación de la vía LHA-LHB.
Sin embargo, en ratones que expresan proteína fluorescente verde o GFP, no se detectó ningún cambio en la señal durante la administración de soplos de aire. Esta técnica permite a los investigadores registrar razonablemente a partir de un tipo específico de células en diferentes regiones cerebrales. Mientras que un animal se comporta libremente.
Esto promueve la capacidad de diseccionar las funciones de estas regiones cerebrales a medida que se relacionan con el comportamiento.
