Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 NS042228 para MCH El confocal Olympus FV1000 fue adquirido con una instrumentación NIH subvención compartida S10RR023717 al Departamento de Zoología de la Universidad de Washington (PI Bement Bill). Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.

1. Montaje de diapositivas y las diapositivas de imágenes de la inyección Diapositivas de inyección: <ol><li> Prepare elastómero de silicona Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Utilice el Sylgard de enlace de tres de vidrio para microscopio estándar portaobjetos, apilando una diapositiva en la parte superior de la intersección de las otras dos diapositivas, que están dispuestos lado a lado en los bordes largos. El carro superior crea una esquina en ángulo recto o &quot;muro&quot; entre la parte superior e inferior se desliza. </li><li> Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables. </li></ol> Imágenes de diapositivas: <ol><li> Nosotros usamos rectángulos de acero inoxidable cortado con el mismo tamaño de un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar (75mm x 25mm x 1mm) por lo que la cámara se ajusta el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Un agujero de 1,5 cm se corta en el centro del rectángulo. </li><li> Ponga un cubreobjetos de 22 mm 2 para el rectángulo de metal con Sylgard. Use sólo lo suficiente para sellar completamente Sylgard el cubreobjetos. A la imagen en un microscopio invertido, los embriones se monta en este cubreobjetos y la imagen de abajo. </li><li> Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables y se limpia con etanol al 70% entre los usos. </li></ol> 2. Preparación de construcciones de ADN Para expresar un transgén en un tejido específico, el gen de interés se clona detrás de un promotor específico de las células. Usamos un elemento cis-reguladoras del gen de pez cebra neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 o el gen SOX10 (-4.9sox10) 3 para dirigir la expresión en las neuronas sensoriales o las células de la cresta neural, respectivamente. Para visualizar la dinámica celular y la membrana, expresamos citoplasma o fluoróforos localizado a la membrana. A la imagen de la F-actina de distribución, que expresa el ADN que codifica el dominio de homología calponin de utrofina fusionado a mCherry (UtrCH-mCherry). La sonda UtrCH-mCherry biosensor permite la visualización de la F-actina, sin interferir con la dinámica de actina 1. Generamos estas construcciones de ADN utilizando la puerta de enlace Invitrogen recombinación estrategia basada en la clonación de 4 y vectores siempre en el pez cebra Tol2kit 5. <ol><li> Generar vector de expresión (s) con varios sitios-Gateway Tecnología y vectores de la Tol2kit pez cebra 5. Plásmidos contienen la columna vertebral de Tol2 pT2KXIGDin. </li><li> Purificar el ADN plásmido con QIAfilter plásmido kit de preparación Midi (QIAGEN Inc.) y eluir con agua estéril. El ADN no tiene por qué ser lineal para la inyección. </li></ol> 3. La inyección de construcciones de ADN <ol><li> Diluir el ADN a una concentración final de 10-50 mg / ml de ADN en el 0,2% de rojo fenol (para la visualización durante la inyección) en el agua. </li><li> Relleno y calibrar la aguja: Volver a llenar una aguja sacó capilar con aproximadamente 1 l solución de ADN e insertarlo en el soporte de la aguja del aparato de inyección (se utiliza un Picospritzer). Con una pinza fina, romper la punta de la aguja de modo que la apertura de la punta es de aproximadamente 10 mm de diámetro. Mida el diámetro de la gota de aceite mineral con un micrómetro ocular. Ajustar la configuración de la presión de tiempo para obtener una gota de aproximadamente un volumen de la Liga Nacional. </li><li> Recoger una de las células de embriones etapa de embrión en un medio de E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm de CaCl2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transferencia de aproximadamente 30-60 embriones a la diapositiva de la inyección y la posición de los embriones en la esquina en ángulo recto formado entre la parte superior e inferior se desliza. Eliminar la mayor parte de la E3, para que los embriones se mantienen a la diapositiva por la tensión superficial. </li><li> Use un alfiler doblado la disección de embriones para rotar por lo que la célula está contra la pared de la diapositiva de la inyección. </li><li> Use un micromanipulador para guiar la aguja a través del corion del embrión, a través de la yema de huevo y en la única célula del embrión. Se inyecta 0,5-1 solución de ADN nl en la célula. </li><li> La transferencia de los embriones en placas de Petri en el E3 y se incuba a 28,5 º C. Si es necesario, el desarrollo puede ser frenado mediante la incubación de los embriones a una temperatura más baja. </li></ol> 4. Embriones de montaje de imágenes <ol><li> Retire el corion de los embriones con unas pinzas finas de aproximadamente una hora antes de los embriones llegan a la edad deseada para la imagen (aproximadamente 14-17 horas después de la fertilización para nuestros propósitos). </li><li> Seleccionar los embriones con células marcadas con un microscopio de disección equipado con fluorescencia. Nosotros usamos un objetivo de 4X (40x) en un ámbito Nikon AZ100 debido a su combinación de larga distancia de trabajo y una gran ampliación. </li><li> Lugar a un embrión en un tubo de microcentrífuga con aproximadamente 50 l E3 que contiene 0,2% tricaína anestesia (concentración 10 veces). </li><li> Añadir 500 l 1% de agarosa de bajo punto de fusión en el E3 con 10 mM HEPES (mantenido a 42 ° C), diluyendo la tricaína a una concentración final de 0,02%. </li><li> Inmediatamente la transferencia del embrión en una caída de agarosa alcubreobjetos de la diapositiva de imagen utilizando una amplia gama de pipetas de vidrio diámetro. </li><li> Antes de la agarosa se endurece, la posición del embrión para la región con células marcadas es hacia abajo, contra el portaobjetos inferior (abajo dorsal de las células de la cresta neural y dorsolateral abajo de la columna vertebral neuronas sensoriales). </li><li> Ensamble de cámara de imagen: Cubra un lado de un anillo de plástico (2 cm de diámetro exterior, 3 mm de alto) con grasa de silicona al vacío y colocar a la diapositiva de imagen de metal. Escudo del otro lado del ring con grasa. </li><li> Llenar la cámara con el E3 que contiene HEPES 10 mM y 0,02% tricaína. Selle la parte superior la cámara mediante la colocación de 22 mm 2 cubreobjetos a la superficie superior del anillo engrasado. </li></ol> 5. Imágenes 4D del comportamiento celular en el Olimpo FV1000 confocal con IX81 microscopio Los detalles de la adquisición de la imagen dependerá de los detalles de su sistema de microscopía. A continuación se describe el proceso de adquisición de lapso de tiempo para la Olympus FV1000 microscopio confocal. Ver el protocolo anterior JoVe para la adquisición de lapso de tiempo con el Zeiss LSM 510 confocal sistema 6. <ol><li> Coloque la cámara de imágenes en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio y se centran en el embrión con un objetivo 20X 10X o bajo luz transmitida. </li><li> Cambiar a un objetivo de 60x (NA de 1.2 o superior) y se centran en la celda marcada con epifluorescencia. Nosotros usamos ni una inmersión en aceite (UPLSAPO 60xO NA 1,35) o de inmersión en agua (UPLSAPO 60xW NA 1.20) de la lente. </li><li> En el software de FV (Ver 1.7c), haga clic en la repetición de XY para iniciar la digitalización láser. </li><li> Ajustar los valores de adquisición y control de adquisición de imágenes (de salida del láser, velocidad de exploración, HV, ganancia y niveles de compensación) para optimizar la señal, manteniendo la potencia del láser, como mínimo (25% o menos) para evitar daños en los tejidos y reducir photobleaching. </li><li> Para adquirir una de la serie Z, establecer los límites superior e inferior de la z-stack, junto con el tamaño de paso. Asegúrese de que el icono de profundidad se dedica a fin de que el icono de barrido XY XY y Z destacó. Iniciar la adquisición haciendo clic en el icono de Barrido XYZ. </li><li> Para adquirir una serie de lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo y el número de puntos de tiempo bajo el título TimeScan en la ventana de Configuración de la adquisición. Haga clic en el icono de tiempo en la ventana de control de imagen de adquisición para que el icono de barrido XY XY (Z) y destacó T. Iniciar la adquisición, haga clic en el gráfico XY (Z) en el icono Barra T. </li><li> Por otra parte, la TimeController se puede utilizar para establecer un lapso de tiempo. Esta programación es útil cuando se generan grandes cantidades de datos, ya que no exceda la asignación de memoria. En Dispositivo, abra la ventana TimeController. Crear una tarea nueva imagen. La ventana de parámetros de imagen se abrirá. Haga clic en el botón Estado de FV para actualizar los ajustes de adquisición. Asegúrese de guardar y Eliminar se observan bajo el título Terminar. Establecer el nombre del archivo de salida y haga clic en Aceptar para guardar la configuración y cerrar la ventana. Utilice la función de bucle para establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de puntos de tiempo. Haga clic en Listo y en Iniciar para comenzar la adquisición. La pausa y cambio de funciones-Z se puede utilizar para reorientar al mismo tiempo de imagen. </li></ol> 6. Resultados representante Las cifras y las películas muestran ejemplos de las neuronas sensoriales y las células de la cresta neural marcada con fluoróforos específicos de membrana o la sonda biosensor de actina. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Confocal de imágenes (z-proyecciones) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embriones transgénicos inyectados con 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Las etiquetas mCherry-CAAX una neurona roja (A) en un fondo con todas las neuronas sensoriales-Barba Rohon etiqueta verde (B). C) imagen combinada de los canales verde y rojo. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 confocal z-proyecciones de las neuronas en embriones inyectados con aproximadamente 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) Rohon-Barba neuronas sensoriales en el embrión HPF 16,5. F-actina de la señal es fuerte en los conos de crecimiento (puntas de flecha) y salientes a lo largo de los axones de reciente formación. B) de neuronas en embriones HPF 20 mostrando una fuerte señal de la F-actina en los conos de crecimiento de los axones ramificados periférica (puntas de flecha) y el más débil de la señal en el centro de mayor madurez axones (flechas). Barra de escala = 50 micras.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

La concentración óptima de ADN inyectado puede variar dependiendo del tamaño y la fuerza del promotor de la construcción y debe ser determinada empíricamente. La inyección de ADN en exceso puede conducir a los embriones saludables con una extensa muerte celular, mientras que muy poco se traducirá en una proporción muy pequeña de los embriones inyectados expresar el transgén. El nivel de expresión de ADN se correlaciona con la fuerza de la señal de fluoróforo, el cual varía de célula a célula. Aunque la c...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

El pez cebra es un modelo ideal de comportamiento celular durante el desarrollo de imágenes en vivo. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y por lo tanto fácilmente accesible en todas las etapas de desarrollo. Además, su claridad óptica permite imágenes de alta resolución de la célula y de dinámica molecular en el medio natural del embrión intacto. Estamos utilizando un enfoque de imágenes en vivo para analizar los comportamientos celulares durante la migración neuronal células de la cresta y la consecuencia y la orientación de los axones neuronales. Imágenes en vivo es particularmente útil para comprender los mecanismos que regulan los procesos de motilidad celular. Para visualizar los detalles de la motilidad celular, tales como la actividad protrusiva y dinámica molecular, es ventajoso para etiquetar las células individuales. En el pez cebra, la inyección de ADN plásmido se obtiene un patrón de mosaico la expresión transitoria y ofrece claras ventajas sobre otros métodos de etiquetado celular. Por ejemplo, las líneas transgénicas con frecuencia etiqueta a poblaciones enteras de células y por lo tanto pueden dificultar la visualización de las protuberancias finas (o cambios en la distribución molecular) en una sola célula. Además, la inyección de ADN en el estadio de una célula es menos invasiva y más precisa que las inyecciones de colorante en las etapas posteriores. Aquí se describe un método para el etiquetado de cada desarrollo de las neuronas o las células de la cresta neural y las imágenes de su comportamiento in vivo. Se inyecta el plásmido de ADN en una célula de embriones etapa, que se traduce en la expresión del transgen mosaico. Los vectores contienen células específicas de los promotores que dirigen la expresión de un gen de interés en un subconjunto de neuronas sensoriales o las células de la cresta neural. Proporcionamos ejemplos de células marcadas con GFP membrana selectiva o con una sonda de biosensor que permite la visualización de la F-actina en las células vivas 1. Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.3K vistas.  University of Wisconsin-Madison. Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Video: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...