Agradecemos a los miembros del laboratorio Rosenblatt para los debates científicos, sugerencias y comentarios. También nos gustaría agradecer a María Halloran, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica RFP-UtrCH Grunwald y David, que siempre que el CK: GFP pez cebra transgénico. Gracias también a Gretchen Rey y el personal de los recursos de pez cebra centralizada en la Universidad de Utah para el mantenimiento de una excelente y el cuidado del pez cebra. Esta labor fue apoyada por Premio a la Innovación de Nueva NIH-NIGMS director de los NIH de un DP2 OD002056-01 a JR. GTE fue apoyado por el NIH Multidisciplinario del Cáncer Programa de Capacitación 5T32 subvención CA03247-8.

Flujo de trabajo básico para la visualización de la dinámica de actina durante la extrusión celular en la epidermis del pez cebra en desarrollo La epidermis del pez cebra en desarrollo se compone de dos capas distintas, la capa superficial (o peridermis) y una capa basal de células que en contacto con la membrana basal 2. Las células de la capa superficial externa someten a la apoptosis y se eliminan de los tejidos por extrusión 3 (Figura 1). Para visualizar este proceso en tiempo real, se inyecta el ARN que codifica la proteína fluorescente de color rojo unido al dominio de homología calponin de utrofina, una proteína de unión actina (RFP-UtrCH) 4,5, en una de las células etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP ) bajo el epitelio estratificado promotor citoqueratina 8 6 (Figura 2A). A pesar de RFP-UtrCH se expresó doquier en los animales después de la inyección de ARN, que se centran en las células superficiales epidérmicas que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y RFP para seguir la dinámica de actina en concreto en la epidermis (Figura 2B). A continuación, el tratamiento de las larvas con G418 para inducir extrusión celular por apoptosis y la imagen de los filamentos de actina y la epidermis con un microscopio confocal de disco giratorio y adquirir bases de datos 4D. Antes de iniciar el experimento <ol><li> In vitro transcribir el ARN a partir de una plantilla de ADN lineal con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) y purificar el ARN tope utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Diluir el ARN a ~ 60ng/ul con agua estéril, hacer 3-5μl alícuotas y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para la inyección. Nota: Evite congelar repetitivas / descongelación para impedir la degradación del ARN. </li><li> Hacer un molde para mantener los embriones durante la inyección mediante el vertido de 40 ml de agarosa al 2% en medio de embriones E3 (E3) en una placa de 100 x 15 mm cultura y la colocación de un molde de microinyección (Adaptive Herramientas de Ciencia, # I-34) en esta bandeja. Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar el molde para exponer los senos de la agarosa. Guarde la placa a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Tire las agujas de inyección capilar para el uso de vidrio de borosilicato con filamentos (OD 1,0 mm, 0,78 ID, longitud 10 cm) y un Sutter P-97 Extractor de una pipeta en los siguientes valores (Heat 485, Tire 50, Velocidad 60, Delay / Hora 90, de presión 200 ). Nota: Los diferentes tipos de vidrio se requiere la optimización de las condiciones mencionadas. </li><li> Representan el 1% de baja fusión (LM) de agarosa en E3 y almacenar alícuotas de 1 ml a 42 ° C. Ten cuidado ya que la evaporación del E3 de las reservas puede aumentar la concentración de agarosa. </li><li> Mantener el pez cebra adulto en condiciones de laboratorio estándar, con un regular de luz / oscuridad ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad 7. La noche antes de la configuración del experimento los peces a su compañero mediante la colocación de 3 mujeres y 2 hombres en un tanque separados por un divisor. A la mañana siguiente, cambiar el agua en el tanque y sacar el divisor cuando las luces se encienden. </li></ol> 1. La inyección de ARN que codifica la proteína actina marcado con fluorescencia Encuadernación <ol><li> Descongele el ARN en el hielo. Añadir un 0,5% de rojo fenol al ARN en una proporción de 1:1 para una final de la concentración de ARN del ~ 30ng/μl y la carga de solución 1μl en una aguja capilar tiró por atrás de llenado. </li><li> Recoge un ~ 75 células etapa 8 CK: embriones GFP en el E3. Pipeta de la recogida de embriones en el molde de la microinyección con una pipeta Pasteur 5 ¾ y orientar suavemente los embriones en el canal con FST Dumont # 5 fórceps. Nota: Tenga cuidado al trabajar con rapidez para evitar la inyección en un embrión en su fase de varias celdas, lo cual puede resultar en la expresión del mosaico de la ARN inyectada. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico estándar de laboratorio de disección, se inyecta el ARN en la yema de los embriones con un microinyector controlada por presión (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-inyector). Un punto rojo (rojo fenol) debe ser visible en el embrión después de la inyección. Inyectar por lo menos 50 embriones para cada experimento. (Vea el protocolo JoVe anterior para un protocolo detallado de inyección de ARN en embriones de pez cebra 9). Nota: <ol type="A"><li> Un volumen de ~ 2NL se debe utilizar para la inyección de ARN en una célula de embriones etapa. Para determinar la cantidad de ARN inyectado, prescindir de un bolo de la ARN en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro calibrado o con un microscopio con una barra de escala construido por los oculares. La gota de la ARN debe ser una esfera perfecta. Calcular la cantidad entregada por medio de la ecuación: Volumen (en nl) = 4/3πr 3. Ajustar el volumen entregado por el cambio de la presión de inyección o el tiempo en el instrumento. </li><li> También se deberían tomar para inyectar la menor cantidad de ARN que permite la visualización del fluoróforo, como altas concentraciones de ARN pueden ser tóxicos para el embrión en desarrollo. Para determinar el nivel de expresión apropiado, un experimento de dosis de la curva se debe realizar antes de ejecutar el experimento. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Clasificar los embriones para eliminar los huevos no fertilizados o dañadas y colocar todos los embriones sobrantes a 28,5 ° C. </li><li> Después de 24 horas, usar un microscopio de fluorescencia de disección para seleccionar embriones de pez cebra que tienen un alto nivel de las buenas prácticas agrarias (epidermis) y la fluorescencia de RFP (actina). Colocar los embriones seleccionados a 28,5 ° C hasta que esté listo para proceder con el tratamiento con fármacos para inducir la apoptosis. </li></ol> 2. La inducción de la extrusión celular en larvas de pez cebra con G418 Hemos encontrado que la exposición al antibiótico aminoglucósido G418, o geneticina, provoca la apoptosis y la extrusión de las células epidérmicas en el desarrollo de larvas de pez cebra 3 por un mecanismo desconocido. Es importante destacar que este tratamiento sólo funciona en las larvas que son cuatro días después de la fecundación en adelante. Nos encontramos con que ~ 25.5 células pueden encontrarse en la extrusión en un momento dado de la aleta epitelial del G418 tratados larvas de pez cebra. Como la cantidad de células apoptóticas extrusión puede variar de un pez a, le recomendamos el montaje de pescado múltiples imágenes. <ol><li> Recoger y colocar cuatro días después de la fertilización (dpf) larvas de pez cebra exhibiendo las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia en una placa de 35 x 10 mm de la cultura que contiene 3 mililitros (ml) de la E3. Uno puede tratar hasta 25 larvas en esta placa de cultivo de tamaño. </li><li> Vuelva a colocar cuidadosamente los medios de comunicación con 3mLs de 1mg/ml E3 que contiene larvas de G418 y se incuban en el medicamento durante 4 horas a 28,5 ° C. Tenga en cuenta que G418 es sensible a la luz, así que tenga cuidado para mantener la placa de cultivo cubierto o en la oscuridad. </li><li> Eliminar los medios de comunicación y reemplazarlos con pre-calentado 28,5 ° C E3 Media que contiene 0,02% tricaína y proceder a la fijación de las larvas. </li></ol> 3. Las larvas de pez cebra de montaje de imágenes <ol><li> La transferencia de 3 larvas de un tubo eppendorf de 1,5 ml y eliminar la mayor parte de la E3 después de que el disipador de peces hasta el fondo del tubo. Hemos encontrado que hasta el 3 animales puede ser montado correctamente antes de la agarosa solidifica. </li><li> Usando una punta de pipeta corte, 120ul pipeta de 1% de agarosa LM-(42 ° C) en el tubo, mezclar, y luego una pipeta suavemente las larvas y la mezcla de agarosa en el cubre objetos en el fondo de una placa de cultivo MatTek. </li><li> Utilizando un soporte FST pin con una clavija de inserción o de aguja de tungsteno, orientar rápidamente las larvas por lo que son rectos y planos contra el cubre objetos del plato MatTek. Nota: Se suelen usar un alfiler para orientar primero la larva y luego un pin en forma de L para asegurarse de que son planas contra el cubre objetos, mientras que la prevención de daños a los especímenes. </li><li> Una vez que la agarosa se ha solidificado, vierta el plato con la E3 que contiene 0,02% tricaína. Nota: Como alternativa, G418 se puede agregar a la E3 en el plato de imagen para seguir la inducción de la extrusión, aunque a largo plazo la exposición a 1mg/ml G418 va a matar a las larvas. </li></ol> 4. Imágenes en directo de la dinámica de actina y los comportamientos individuales células epiteliales durante la extrusión celular utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Hemos encontrado que todo el proceso de extrusión celular apoptótica de la epidermis de desarrollo de larvas de pez cebra se tarda aproximadamente 20 minutos 3. Aquí se demuestra cómo configurar un experimento de time-lapse para recoger una serie de planos z a través de una sola capa de la epidermis del pez cebra para visualizar el proceso de extrusión. Hemos encontrado que la típica de los microscopios de campo amplio fluorescentes causa importante photobleaching de los filamentos de actina y no permiten obtener imágenes timelapse. Por lo tanto, para maximizar nuestra resolución y prevenir photobleaching, se utiliza un microscopio confocal de disco giratorio. A continuación se describe cómo configurar el experimento usando el software IQ Andor con un microscopio Nikon, aunque los principios que se discuten se pueden aplicar a microscopio similares set-ups. <ol><li> En primer lugar, a su vez en el argón (para la excitación de las buenas prácticas agrarias en 488 nm) y HeNe (para la excitación de la RFP a 561nm) láser, microscopio, cámara y la lámpara de epifluorescencia. </li><li> Dentro del software Andor IQ (versión 1.10.1), crear un protocolo de series de tiempo que contiene las longitudes de onda que desee a la imagen, la frecuencia de los intervalos entre las capturas de imágenes y el número de veces de la captura se debe repetir. </li><li> Con cuidado, coloque el plato que contiene MatTek su muestra en la platina del microscopio y el uso de un objetivo de 20x con luz transmitida a centrarse en las larvas. </li><li> Mueva el objetivo de inmersión en agua 40 veces (NA 0,8) en la posición correcta. El uso de este objetivo, podemos filmar aproximadamente 20 a 25 células por campo, lo que nos permite seguir los comportamientos celulares durante la extrusión a la vez que la resolución subcelular dinámica de la actina. Nota: El montaje mismo y las estrategias de imagen se pueden aplicar a microscopios verticales, aunque un objetivo de inmersión en agua 40 veces con una distancia de trabajo debe ser utilizado. </li><li> Con cuidado, coloque una gota de agua en la parte superior del objetivo de 40x y poner rápidamente el plato MatTek en la parte superior. Noe: Zeiss solución de inmersión Immersol también se puede utilizar si la evaporación del agua es un problema. </li><li> Identificar la muestra con la fase o la iluminación DIC y luego usar epifluorescencia 488nm para centrarse específicamente en la epidermis GFP positivos. </li><li> Cambiar al modo confocal de barrido. Ajustar la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada uno de los canales (488nm y 561nm) en consecuencia. Tenga cuidado de equilibrar la potencia del láser y el tiempo de exposición para la detección óptima de la señal y evitar que se photobleaching o toxicidad. </li><li> Para identificar las células de extrusión, el uso de epifluorescencia para visualizar la GFP etiquetados epidermis e identificar a un grupo de células en un patrón de roseta clásico, que consiste en un conjunto de células que rodean una pequeña celda redonda en el centro. Usando el modo confocal de barrido, también debería ser una acumulación de la actina RFP marcado visible como un anillo alrededor de la célula pequeña y redonda en el medio, un sello distintivo de la extrusión de la célula. Una vez que haya identificado una célula de extrusión, configurar rápidamente el microscopio para adquirir 4D (XYZ-Time) datos confocal. </li><li> Establecer los puntos superior e inferior en el plano z para visualizar una sola capa de la epidermis, incluida la celda de extrusión, y seleccionar el tamaño del paso. Por lapso de tiempo de imágenes, ajustar los intervalos de captura de imágenes y el número de repeticiones. Por ejemplo, adquieren una z-series que abarcan 5-10μm, con un tamaño de micras un paso, cada 1-2 minutos durante 30 minutos. </li><li> Para ver los datos, que suelen hacer las proyecciones 3-D de la serie Z y guardar el conjunto de datos como un archivo de película que es compatible con QuickTime (Apple). De esta manera, podemos visualizar la contracción del anillo de actina y los comportamientos epiteliales que se producen alrededor de la célula que muere con el tiempo. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema de la extrusión de las células apoptóticas. Los filamentos de actina se muestran en rojo, las células epidérmicas de GFP positivos son de color verde. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Flujo de trabajo experimental. A. Esquema del flujo de trabajo para el experimento. B. Expresión de la RFP-UtrCH en la epidermis de un CK 4dpf: GFP pez cebra. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Sin embargo marcos (z-proyecciones) de una película de lapso de tiempo que sigue viva la dinámica de actina durante el proceso de extrusión de las células epiteliales. Las flechas indican el anillo de actina formado por las células vecinas que se contrae y se cierra en el transcurso de 2 minutos.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

Garantía de bienestar de los animales Todos los procedimientos realizados en el presente protocolo con el pez cebra, Danio rerio, han sido aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Utah (Aseguramiento de Bienestar Animal # 10-07017).

El protocolo se describe aquí se muestra un método simple y sencillo de visualizar el proceso de extrusión en un tejido epitelial en vivo. Este tipo de experimento nos permite examinar las sutilezas de la dinámica de actina no se había supuesto en los análisis de tejidos fijados, y por lo tanto, complementa los métodos comunes de inmunofluorescencia. Podemos utilizar este protocolo en combinación con inhibidores químicos o mutantes genéticos para analizar mejor el proceso de extrusión y los estados estudiar l...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Reactivo </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> Reactivo </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> Tanques que cruzaban </td><td> Herramienta </td><td> Thoren de Sistemas Acuáticos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La bomba de pipeta </td><td> Herramienta </td><td> Bel Art Productos </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ pipeta Pasteur </td><td> Herramienta </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinyección del molde </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de adaptación Ciencia </td><td> I-34 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de 100x15mm </td><td> Herramienta </td><td> Pescador </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipeta Extractor </td><td> Herramienta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modelo P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidrio de filamento </td><td> Herramienta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, 0.78mm ID, longitud 10 cm </td></tr><tr><td> Jar electrodo de almacenamiento </td><td> Herramienta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td><td> 0,5% en DPBS </td></tr><tr><td> Presión controlada y microinyector Micromanipulador </td><td> Herramienta </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de 35x10mm </td><td> Herramienta </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (geneticina) </td><td> Reactivo </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 mg / ml en dH 2 0 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm Pin titular </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> Inserte las clavijas </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26007-02 y 03 </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo de vidrio Cultura plato con 1,5 cubreobjetos </td><td> Herramienta </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa Low Melt </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Fluorescentes microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio confocal de disco </td><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td> Eclipse Ti </td><td> Equipado con un cabezal de disco Yokagawa spinning </td></tr><tr><td> Cámara CCD </td><td> Cámara </td><td> Andor </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 micrones cuadrados píxeles </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

Mantenimiento homeostático de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas sin afectar la función de barrera. Nuestros estudios han encontrado que las células que mueren enviar señales a sus vecinos en vivo para formar y contratar a un anillo de actina y miosina que se expulsa hacia fuera de la hoja epitelial al cerrar las lagunas que pudiera haber resultado de su salida, un proceso llamado extrusión de la celda 1. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. Aquí se describe un método para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra. Para visualizar la extrusión, se inyecta una sonda roja de la proteína fluorescente etiquetados para la F-actina en los embriones de una célula etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente en la epidermis e inducir la apoptosis mediante la adición de G418 para las larvas. A continuación, el uso del tiempo-lapse de imágenes en un microscopio confocal de disco giratorio para observar la dinámica de actina y los comportamientos de las células epiteliales durante el proceso de extrusión celular por apoptosis. Este enfoque nos permite investigar el proceso de extrusión en vivo epitelio y proporcionar una vía para estudiar los estados de enfermedad causada por la falta de eliminación de células apoptóticas.

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.6K vistas.  University of Utah. Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Video: Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Investigación

Biología

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.