Comience colocando una ratona embarazada sacrificada en su espalda en una tabla de disección. Con fórceps, pellizque la línea media abdominal. Con un par de tijeras afiladas, corte el abdomen a través de la piel y el peritoneo desde los genitales hasta la caja torácica sobre la línea media.
Retire el útero que contiene los embriones y colóquelo inmediatamente en hielo. Corte cuidadosamente a través del saco vitelino en los lados de la placenta y retire los embriones. Luego, coloque las cabezas embrionarias decapitadas en una placa helada que contenga HBSS deficiente en calcio y magnesio.
Coloque la cabeza en un plato de 35 milímetros mirando hacia la izquierda. Perfore un ojo con el borde de los fórceps, sosteniendo firmemente la barbilla con el otro. Rasgue suavemente la piel del cuero cabelludo desde la nuca a lo largo de la línea media hacia el hocico.
Use los fórceps en ángulo para entrar a través de la médula espinal ovalada blanca y abra el cráneo a lo largo de la línea media, exponiendo el cerebro. Despegue suavemente el cráneo de los lados. Luego, levante el cerebro fuera del cráneo y deséchese del cráneo.
Use fórceps para extirpar las meninges. Coloque los cerebros en una bisutería que contenga dos mililitros de HBSS deficiente en calcio y magnesio. Agregue 250 microlitros de tripsina 10X a la bisutería.
Triturar los cerebros agitando la bisutería y luego incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue dos mililitros de inhibidor de tripsina de soja a cada bisutería. Agite para dispersar el inhibidor de manera uniforme.
Sin centrifugar, transfiera dos mililitros del sobrenadante de cada bisutería a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Usando una aguja de calibre 19 conectada a una jeringa de cinco mililitros, aspire la suspensión dos veces para triturar las células restantes en la bisutería. Repita la aspiración dos veces con una aguja de calibre 21.
Con una aguja de 23 G, transfiera las células de la bisutería al tubo de centrífuga de 15 mililitros que contiene el sobrenadante celular y centrifugar a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta serológica de cinco milímetros, transfiera todo el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros sin alterar el pellet. Repita la centrifugación.
Agregue 10 mililitros del medio de recubrimiento a un tubo que contenga los gránulos combinados de ambos pasos de centrifugación y mezcle bien para crear una suspensión completa. Tiñe las células con azul de tripano y cuenta con un hemocitómetro o un contador celular. Coloque las células agregando el volumen requerido de la suspensión de células cerebrales embrionarias murinas E17 en una placa de pozo.
Incubar las células a 37 grados centígrados bajo 5 a 7% de dióxido de carbono durante dos a cuatro horas. Después de quitar los medios, agregue nuevos medios de diferenciación a cada pocillo. Presione hacia abajo cualquier cubierta flotante con una punta de pipeta estéril.
Mantenga los cultivos eliminando parte del sobrenadante y reemplazándolo con medios de diferenciación frescos tres veces por semana. Los cultivos se visualizaron mediante tinción de inmunofluorescencia para NG2 y nestina como marcadores de desarrollo, SMI31, MBP y NeuN como marcadores neuronales, y CNP, GFAP e Iba1 como marcadores gliales La infección de cultivos con el virus neurotrópico del bosque Semliki afectó a los oligodendrocitos y las neuronas. Las investigaciones qRT-PCR de las células infectadas demostraron una regulación positiva del ARNm quimiotáctico de la citoquina Ccl5 en cultivos tratados con interferón beta.
Los estudios ELISA mostraron un aumento de Ccl5 en el sobrenadante, mostrando así una correlación entre el ARNm y la expresión de proteínas. Los estudios citométricos de flujo de suspensión unicelular mostraron que el 70% de las células permanecieron viables. Un gran número de microglías, neuronas y astrocitos estaban presentes, mientras que los oligodendrocitos eran los menos abundantes.
