National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 &#38; T32DA007027.

Todo el cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se ajustaron y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Virginia Commonwealth. 1. Preparación de cubreobjetos de vidrio estériles de poli-D-lisina y laminina revestida en placas de 24 pocillos <ol><li> Todos los procedimientos para el paso 1 se llevan a cabo en condiciones estériles; debajo de una campana, y con reactivos estériles. Cubreobjetos de vidrio y agua desionizada doble (ddH 2 O) deben ser esterilizados de antemano. Preparación de las placas puede hacerse hasta dos semanas antes del aislamiento neurona. </li><li> Bajo el capó, use pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave de 12 pocillos de una placa de 24 pocillos. </li><li> Prepare Stock poli-D-lisina antes de tiempo. Añadir 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Mezclar y almacenar en 3 ml alícuotas a -20 ° C. Descongele alícuotas antes de su uso. </li><li> Para obtener una concentración final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por 25 cm 2: pipeta de 80 lde stock poli-D-lisina en la parte superior de cada cubreobjetos de vidrio (2 cm 2). Deje que la solución reposar durante 10 min. </li><li> Retire poli-D-lisina de vacío y enjuague utilizando cubreobjetos de 3x con estéril ddH 2 O. </li><li> Permitir que las placas se sequen durante al menos 2 horas bajo el capó. </li><li> Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C o - 20 ° C antes de proceder al recubrimiento laminina. </li><li> Prepare Stock laminina antes de tiempo. Descongele laminina en hielo y mantener en hielo durante el uso. Diluir a una concentración de 50 g / ml; prestar atención a concentración mucho; cada lote será diferente. Dependiendo de la concentración mucho, se añadieron aproximadamente 20 ml de ddH 2 O a cada vial de laminina. Alícuota (5 ml) y se almacena a -80 ° C. Descongele alícuotas en hielo antes de su uso. </li><li> Cubreobjetos Abrigo con 5 mg / cm 2 laminina; Añadir 200 L de stock laminina en cada portaobjetos. </li><li> Incubar solución de laminina en cubreobjetos durante 1 hora. </li><li> Aspirar solución de laminina restante y enjuagar una vez con cubreobjetosddH 2 O. Evite raspar la superficie del cubreobjetos. </li><li> Placas se almacenan a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. </li></ol> 2. Una preparación previa de la neurona Aislamiento Solutions <ol><li> Prepare una solución de Krebs (en mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO 3, 11 glucosa y 2,5 CaCl2). Place 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g de glucosa (FW 180,2) y 0.555 g de CaCl2 (FW 111) en 2 l ddH 2 0. Enfriar a 4 ° C. </li><li> Preparar enjuague medios (medio F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibiótico / antimicótico): A una botella ml de medio F12 500, añadir 50 ml de FBS y 5 ml de líquido 100x de antibiótico / antimicótico (Gibco). </li><li> Preparar los medios de comunicación neurona entérica (Neurobasal A los medios de comunicación con B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Neurotr derivado de la glíaFactor de ophic (GDNF), y de antibiótico / antimicótico líquido 100x). Para hacer un caldo GDNF, añadir 1 ml ddH2O GDNF a 10 mg y congelar de nuevo en 50 alícuotas, almacenar a -80 ° C. Para un ml frasco de medios de comunicación neurona completos 50, combinar ml Unos medios de comunicación 47.5 Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 l de FBS, 500 mM de L-glutamina (Gibco) 50 de stock GDNF l l, 200 y 500 l antibióticos / Liquid 100x antimicótico. Los medios de comunicación se hace en pequeños lotes de 50 ml para garantizar la frescura de GDNF y para evitar la contaminación de grandes cantidades de esta mezcla de medios de comunicación celular caro. </li></ol> 3. Harvest Longitudinal Plexus (LMMP) Preparación del músculo / mientérico de ratones <ol><li> Éticos nacionales e institucionales apropiadas deben estar en su lugar antes de realizar experimentos con animales. Adultos ratones Swiss Webster que pesan más de 25 g (generalmente más de 8 semanas de edad) se encuentran en grupos de 6 antes de los experimentos. Los tejidos de dos ratones se utilizan para el aislamiento de las neuronas y células gliales entéricas ileales y tres ratones se utilizan paraaislamiento de las células del colon. </li><li> Prepare el área quirúrgica. Reunir pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas anguladas, hisopos de algodón, tres vasos de vidrio de 200 ml, y una varilla de vidrio / plástico (pincel). Asegúrese que todos los materiales son lavados y enjuagados antes de su uso para minimizar la contaminación de fondo. Este paso puede realizarse el día antes del experimento. </li><li> Coloque solución de Krebs en hielo y la burbuja con carbógeno (95% de oxígeno, 5% de CO 2) durante al menos 30 minutos para estabilizar el pH. </li><li> Encienda diversos equipos y los productos químicos calientes para estabilizar a temperaturas deseadas; baño de agua de calor (s) a 37 ° C, centrífuga fresco a 4 ° C, lugar de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y 0,5% de tripsina en baño de agua (37 ° C ). Medios de neuronas completas y enjuague medios de comunicación deben permanecer refrigerados. </li><li> Colocar 150 ml helada burbujea Krebs en tres vasos de vidrio de 200 ml etiquetados &#39;sucia&#39;, &#39;limpio&#39;, y &#39;LMMP&#39;. Vaso de burbuja etiqueta &#39;LMMP&#39; con carbógeno. </li><li> Tras la aprobación del comité de ética, la eutanasia mouse por dislocación cervical o la asfixia de CO 2. </li><li> Coloque el ratón en decúbito dorsal en la superficie quirúrgica, la piel limpia con un 70% EtOH, y levantar la piel del abdomen con unas pinzas. Con unas tijeras, la cavidad abdominal abierta y revelar órganos digestivos internos. </li><li> Retire la longitud del tracto gastrointestinal mediante el levantamiento de una sección de íleon y revelando su mesenterio. Snip través mesenterio con tijeras para quitar suavemente y desentrañar íleon y colon, con cuidado de no tirar de mesenterio del íleon / colon. </li><li> Después de que se descubrió la longitud completa del intestino grueso, eliminar el íleon cortando a través del intestino distal al estómago y proximal al intestino ciego Nota:. Este procedimiento también se puede realizar con el tejido del colon mediante la eliminación de los dos puntos de distal a la proximal al ciego hasta el ano. </li><li> Los tejidos se pueden dividir entre colon proximal y distal, y yeyuno, e íleon. El resto de este procedimiento se referirá al aislamiento del íleon; tque procedimiento es el mismo para el aislamiento de LMMP de colon. Coloque todo el íleon en un recipiente de vidrio con helado Krebs marcado &quot;sucio&quot;. </li><li> Crear una herramienta para limpiar el íleon; contundente una gran aguja de calibre 20 con una piedra de archivo y adjuntarlo a una jeringa grande (10 ml) que contiene helado Krebs. </li><li> Limpiar la materia fecal desde el íleon mediante el seccionamiento del íleon en tres o más piezas de gran tamaño. Eliminar una sección ileal del vaso de precipitados y colocar la aguja roma en el extremo de una pieza ileal. </li><li> Pase suavemente Krebs a través de la sección de intestino hasta que toda la materia fecal se elimina en un contenedor de residuos por separado. Coloque la sección de limpieza en el recipiente de Krebs marcada &quot;limpia&quot;. Repita hasta que se limpie toda íleon. </li><li> Para quitar el LMMP, corte el íleon en pequeños segmentos, aproximadamente 2-4 cm. Coloque un segmento de íleon en un plástico o varilla de vidrio; íleon debe encajar cómodamente, pero no estar suelto o tenso (~ 2 mm). Comienza la retirada del LMMP suavemente quitando trozos de mesenterio todavía adjuntared en el tracto gastrointestinal (GI) usando un fórceps. Evitar que el tracto GI de girar alrededor de la varilla por el fijar suavemente el tubo para la varilla con el pulgar. </li><li> Separar la LMMP del músculo circular subyacente; primera frotar suavemente el borde de las pinzas a lo largo de toda la línea donde se conecta el mesenterio, desde la parte superior a la parte inferior del segmento, creando suavemente un vacío en el músculo longitudinal. A continuación, se burlan suavemente el músculo longitudinal con un bastoncillo de algodón humedecido con Krebs. </li><li> Comience en la parte superior de la brecha en el músculo longitudinal y se burlan de distancia usando el trazo horizontal ligero mientras se aplica una presión muy ligera hasta que el músculo longitudinal empiece a separarse del músculo circular, hacer esto por toda la franja a lo largo del punto de fijación mesenterio. </li><li> Entonces comienzan suavemente para evitar el tubo gastrointestinal, moviéndose de arriba a abajo y de atrás como el músculo longitudinal se separa lentamente del músculo circular todo el camino alrededor del tubo. Cuando esté completo, elLMMP forma natural desprenderse del resto del tubo digestivo. </li><li> Coloque la tira fina resultante de músculo longitudinal en el vaso de precipitados con la indicación «LMMP &#39;. Repita este procedimiento para todos los segmentos. </li><li> Después de todas las franjas de LMMP presentadas proceden de un ratón, repita el procedimiento con los otros ratones que se utilizan. Enjuague los vasos &#39;sucias&#39; y &#39;limpio&#39; antes de volver a usarla. </li><li> Enjuague el LMMP 3x para eliminar la contaminación biológica. Llenar tres 2 ml tubos Eppendorf con helada Krebs. Coloque las tiras LMMP en el primer tubo y girar durante 30 segundos a 356 xg en una centrífuga enfriada a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y mover las tiras a LMMP siguiente tubo lleno de Krebs limpio. Repita este procedimiento para cada tubo restante. </li></ol> 4. Resumen LMMP <ol><li> Preparar la solución de la digestión mediante la colocación de 13 mg de colagenasa de tipo 2 y 3 mg de BSA en 10 ml de solución de Krebs-burbujeó carbógeno. </li><li> Coloque los segmentos de LMMP enjuagado en solución de digestión y uso LICsores para cortar LMMP en pequeños pedazos. </li><li> Resumen LMMP durante 60 min a 37 ° C en baño de agua con agitador mientras se burbujeaba suavemente con carbógeno. </li><li> Después de la digestión es completa, recoger las células por centrifugación durante 8 minutos a 356 xg en centrífuga enfriada a 4 ° C. </li><li> De aquí en adelante todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo celular! Todos los reactivos y los contenedores deberán ser esterilizados antes de su uso. </li><li> Durante la centrifugación, preparar una solución de tripsina 0,05% mediante la colocación de 1 ml calentó 0,25% de tripsina y 4 ml de HBSS calentado en un tubo de ml de cultivo celular estéril 50. </li><li> Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. No utilice una aspiradora, lo que probablemente va a chupar el pellet celular debido a la baja velocidad de centrifugación. Retire cuidadosamente el sedimento celular y el lugar en el tubo limpio con 5 ml de solución de tripsina 0,05%. </li><li> Digerir las células en solución de tripsina 0,05% en baño de agua a 37 ° C con agitación durante 7 min. No exceda 7 min del tratamiento total de tripsina o neuronas perecerá. </li><li> Neutralizar la tripsina con 10 ml de enjuague medios fríos después de 7 min de tratamiento con tripsina. </li><li> Centrifugar las células durante 8 min a 356 x g. Retire y deseche los medios de comunicación. </li><li> Durante la centrifugación, equilibrar una sección de malla Nitex esterilizado en la parte superior de un tubo de 15 ml de cultivo celular estéril. </li><li> Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. Suavemente mezcla de células se resuspende por trituración en ml de medio de neuronas completos 3. Evitar la generación de burbujas de aire durante esta etapa y todos los pasos futuros en los que se tritura mezcla de células. Todas las trituraciones se debe hacer con mucho cuidado. Filtrar a través de solución de células Nitex de malla limpia en 15 ml de tubo de cultivo de células. </li><li> Opcional: tubo de cultivo de células de Cap y el lugar en el mezclador de Hula refrigerado (o cualquier mezclador que proporciona una rotación) con el balanceo y la inclinación suave durante 30 min. Este paso es opcional pero recomendado. </li><li> Opcional: Después de mezclador de Hula, añadir 2 ml de enjuague medios fría para lavar las células. </li><li> Reunir las células por centrifugación (8 min, 356 xg). Quitar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación 1200 neurona completos l. Triturar las células utilizando suavemente 1 ml de plástico punta de la pipeta. No generar burbujas de aire. Pipetear lenta y suavemente hasta que la mayoría de los bloques se dividen y las células se suspenden en líquido. </li><li> Añadir 750 l de medio completo a cada uno de los 12 pocillos que contenían un cubreobjetos de vidrio pre-recubiertas y añadir 100 ml de la solución de células triturado. </li><li> Incubar las neuronas en cultivo celular incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cambie la mitad de los medios celulares cada 2 días. </li><li> Las neuronas son listos para las grabaciones electrofisiológicas después de 1 - 2 días en cultivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+A+second+brain.">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li><li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+lytic,+latent,+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons.">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li><li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li><li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig.">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li><li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig.">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li><li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia.">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li><li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation.">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li><li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels.">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li><li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities:+Introducing+the+neuro-gliopathies.">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li><li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+genetics,+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice.">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li><li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract.">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin.">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li></ol>

The authors declare that no major competing interests exist.

Animals Used
This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and &mu;-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th...

El sistema nervioso entérico (ENS) es vasta red de nervios y glía que recorre toda la longitud del tracto gastrointestinal (GI). La ENS controla funcionalmente todos los aspectos de la digestión, incluyendo el peristaltismo, la absorción / secreción de fluidos, sensación de estímulos, etc (para revisión ver 1). Contiene más de 500 millones de neuronas, más que las encontradas en la médula espinal, y contiene todas las clases neurotransmisor encontrado en el cerebro. Por otra parte, la ENS es única, ya que puede funcionar sin reflejo de entrada desde el sistema nervioso central 2. La comprensión de la ENS es crucial, no sólo para comprender su papel fisiológico normal, pero para comprender su participación en una variedad de neuropatías que pueden ser congénito (enfermedad de Hirschsprung), adquirida (enfermedad de Chagas), secundaria a estados de enfermedad (gastroparesia diabética), drogas inducida (síndrome de intestino narcótico), o debido a una lesión (íleo posoperatorio) 1. Además, las neuronas entéricas pueden ser un reSERVOIR para la infección viral (varicela zoster) 3. Debido a sus similitudes con el cerebro y los altos niveles de serotonina en el intestino, medicamentos destinados a tratar los defectos del sistema nervioso central a menudo tienen efectos secundarios no deseados en la ENS 2. También es digno de mención que muchas neuropatías tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson muestran cambios celulares similares en las neuronas entéricas mucho antes de su aparición en las neuronas centrales, por lo que la ENS un modelo accesible para estudiar la patogénesis de estas enfermedades 4. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la ENS es una necesidad en la comprensión de los estados de enfermedad y la prevención / la predicción de efectos secundarios farmacológicos. Las neuronas de la ENS se han estudiado tradicionalmente en el conejillo de indias usando preparaciones de wholemount 5-7 o neuronas cultivadas 8. A pesar de la facilidad con la que las neuronas pueden ser estudiados en este gran animal, este modelo tiene muchas limitaciones comofalta de cepas modificadas genéticamente, la falta de reactivos específicos para esta especie, y el alto costo asociado con el pedido y albergar estos temas. El desarrollo de un modelo de sistema nervioso entérico murino tiene la ventaja única de diversos sistemas de golpe hacia fuera, una amplia gama de otras metodologías establecidas que pueden ser utilizados en conjunción con la técnica de cultivo celular, y la capacidad de proporcionar una validación para el modelo de cobaya . La ENS se compone de tres plexi que corren a lo largo del tracto gastrointestinal: el plexo mientérico exterior (entre el músculo longitudinal y circular), que es principalmente responsable de las acciones peristálticos del intestino, así como los plexos submucosa y la mucosa, ( encontrado en y dentro de la mucosa, respectivamente), que controla en gran medida la absorción / secreción de fluido y la detección de los estímulos 1. Este método comienza con el aislamiento de la preparación del plexo muscular / mientérico longitudinal (LMMP) por peladofuera de la capa muscular exterior del tracto GI. Esto reduce drásticamente los problemas de contaminación que surgen cuando la capa de la mucosa está involucrado en el aislamiento. Como resultado, este proceso es ideal para el estudio del control neuronal de la motilidad en lugar de acciones de secreción de la ENS. El método que aquí se presenta resultados en un cultivo mixto de las neuronas y células gliales entéricas. Al menos dos tipos diferentes de neuronas se basan presente en las anteriores observaciones electrofisiológicas y inmunocitoquímico 9. La presencia de la glía es muy ventajoso, ya que no sólo son un importante tipo de células a estudiar en su propio derecho, pero que contribuyen a la supervivencia de las neuronas entéricas 10 y mantener la expresión del receptor nativo en la superficie celular neuronal 11. Por otra parte, las deficiencias de la glía entérica pueden conducir a estados de enfermedad motilidad gastrointestinal anormal, acuñadas 12 &#39;neuro-gliopathies. Por lo tanto, la cultura ENS presenta aquí resultados en varios tipos de células que están maduras para la investigación. Las ventajas de este método son la facilidad de aislamiento, requerimientos de herramientas de bajo costo y muy poco tiempo para dominar la técnica por personal de laboratorio con experiencia. Limitaciones de la metodología incluyen el rendimiento general de la célula baja de volúmenes de los tejidos y la exclusión de las neuronas del plexo ENS mucosa y submucosa. Este procedimiento será muy ventajoso para los estudiosos especializados en electrofisiología, inmunohistoquímica, PCR de una sola célula, y otras metodologías.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

El sistema nervioso entérico es una vasta red de neuronas y glía que recorren la longitud del tracto gastrointestinal que funcionalmente controla la motilidad gastrointestinal. Se describe un procedimiento para el aislamiento y cultivo de una población mixta de neuronas y células gliales del plexo mientérico. Los cultivos primarios se pueden mantener durante más de 7 días, con conexiones en desarrollo entre las neuronas y la glía. La tira de músculo longitudinal con el adjunto del plexo mientérico se extrae del músculo circular subyacente del íleon o colon del ratón y se sometió a digestión enzimática. En condiciones estériles, la población de neuronas y glía aislado se conservan dentro del sedimento después de la centrifugación y se sembró en cubreobjetos. Dentro de 24 a 48 horas, neuritas se produce y las neuronas se pueden identificar por marcadores pan-neuronal. Después de dos días en cultivo, aisladas neuronas potenciales de acción del fuego como se observa en los estudios de patch clamp. Por otra parte, la glía entérico también puede ser identifdiado por tinción GFAP. Una red de neuronas y células gliales en estrecha aposición se forma dentro de 5 - 7 días. Neuronas entéricas pueden ser individualmente y estudiado directamente utilizando métodos tales como la inmunohistoquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio, y la PCR de una sola célula. Por otra parte, este procedimiento se puede realizar en animales modificados genéticamente. Esta metodología es simple de realizar y de bajo costo. En general, este protocolo expone los componentes del sistema nervioso entérico de una manera fácil de manipular por lo que podemos descubrir mejor la funcionalidad de la ENS en estados normales y de enfermedad.

Immediately following isolation of LMMP-derived cells, neurons and other cell types will not be readily evident. Living, round cells of indistinct phenotype can be seen as well as tissue detritus from incompletely digested tissue fragments and connective tissue. This flotsam is of no concern and will be largely removed with the first media change in two days. Do not attempt to clean the slides before this as the healthy, viable cells will be removed as well.
After one day in culture, neurons w...

Watch this Scientific Journal Video about An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse at JoVE.com

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.5K vistas.  Virginia Commonwealth University. We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Video: An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Investigación

Neurociencias

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Mouse Adulto Preparación músculo-nervio para estudiar las propiedades de cocción de los aferentes musculares

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning en la banda Theta Hippocampal<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...