Para comenzar, coloque a los ratones anestesiados en la plataforma quirúrgica. Después de recortar el cabello, aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para evitar que se sequen. A continuación, fije a los ratones en un aparato estereotáxico para su inmovilización.
Haga una pequeña incisión bajo un microscopio para exponer completamente el cráneo. Prepare dos jeringas de 10 microlitros, una que contenga el ARNsh del receptor AAV2/5-adenosina 2A y la otra que contenga AAV2/5 scramble. A continuación, utilice el microscopio para localizar el bregma y la lambda y establezca el punto de coordenadas en la jeringa de 10 microlitros basándose en el atlas estereotáxico del cerebro del ratón.
Perfora un pequeño agujero en el cráneo en el punto de coordenadas establecido. Inyecte dos microlitros del virus del ARNh del receptor AAV2/5-Adenosina 2A en el ventrículo cerebral mediante inyección lateral a una velocidad constante de 100 nanolitros por minuto. Mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos antes de retirarla.
Selle la piel lesionada rápidamente con pegamento médico de biofibrina para evitar la pérdida de virus. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica, manteniendo su temperatura corporal aproximadamente a 37 grados centígrados para facilitar la recuperación. Inyectar dos microlitros de CRE-TAT Recombinasa en cada ventrículo lateral de ratón tomate Arosa L-D-L-T-D para el grupo experimental, y dos microlitros de PBS estéril para el grupo control.
Dos semanas después de la inyección de recombinasa CRE-TAT, preparar secciones de tejido congelado, realizar la tinción nuclear y preparar el portaobjetos para la obtención de imágenes La eliminación del receptor de adenosina 2A en el plexo coroideo en ratones fundidos con receptor de adenosina 2A homocigótico, utilizando CRE-TAT, condujo a una disminución de las puntuaciones clínicas de EAE. Del mismo modo, la eliminación del plexo coroideo en ratones salvajes con receptor de adenosina 2A, utilizando AAV2/5 shRNA, disminuyó las puntuaciones clínicas de EAE. El análisis de QPCR mostró que los niveles de ARNm del receptor de adenosina 2A disminuyeron en los grupos AAV2/5 shRNA y CRE-TAT, en comparación con cada control.
El silenciamiento del receptor de adenosina 2A, específicamente en el plexo coroideo, redujo la infiltración de células inmunitarias en la médula espinal.
