ونعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31800903، الممنوحة ل W. Zheng) ومشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم Y2020426، الذي منح إلى Y. Y. Weng) لهذا العمل.

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ونتشو الطبية.
1. الحيوانات
<ol><li>شراء ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ويزن 20-22 جم.</li>
	<li>احصل على خط الفأر Rosa-LSL المعدل وراثيا (Lox-StoP-Lox) -tdTomato (Ai9) ، وذكور الفئرانA 2AR flox/ flox .</li>
	<li>قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين والمنزل في أقفاص ، بحد أقصى خمسة فئران لكل قفص ، تحت دورة مظلمة قياسية مدتها 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوع واحد.</li>
	<li>تزويد الفئران بما يكفي من الطعام والماء والحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة عند 25 درجة مئوية.</li>
</ol>2. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2ARs مع AAV2 / 5-shRNA
<ol><li>وزن كل ماوس وكتابة القيم.</li>
	<li>تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ من صوديوم بنتوباربيتال بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال ، وضع الماوس على وسادة تدفئة لإبقائه دافئا. ملاحظة: من الضروري إعطاء الجرعة الصحيحة من صوديوم بنتوباربيتال وفقا لوزن الفأر لضمان نجاح الجراحة. يجب ألا يكون التخدير عميقا جدا ، لأنه قد يؤدي إلى الوفاة ، ولكن لا ينبغي أن يكون ضحلا جدا ، حيث قد يستيقظ الفأر أثناء العملية ، مما قد يؤثر على فعالية حقن الفيروس. تحقق من جرعة التخدير المناسبة عن طريق قرصة إصبع القدم وتأكد من أن الفئران لا تستجيب.</li>
	<li>استخدم ماكينة حلاقة فأر متخصصة لقص الشعر العلوي للفئران المخدرة.</li>
	<li>ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف ، وقم بتثبيت الفئران على جهاز تجسيمي لشل حركة الدماغ. تغطية الحيوان مع ثنى معقمة.</li>
	<li>تعقيم جلد الرأس والرقبة من الفئران تماما مع ثلاث جولات من مطهر اليودوفور والكحول 75 ٪ للحد من العدوى بعد العملية الجراحية. ثم ضع 1٪ يدوكائين موضعيا على فروة رأس الفئران وقم بعمل شق صغير لفضح الجمجمة بالكامل تحت المجهر. ملاحظة: استخدم أدوات معقمة طوال العملية.</li>
	<li>قم بإعداد حقنتين سعة 10 ميكرولتر: واحدة مع AAV2 / 5-A 2A R-shRNA المشتراة (عيار: 6.27 × 10 9 vg / μL) والأخرى مع AAV2 / 5-Scramble المشتراة (عيار:6.21× 109 vg / μL). ملاحظة: عند استخدام المحقنة ، يجب توصيل الواجهة الأمامية بشعيرات زجاجية ، ويمكن الحصول على نطاق 10 ميكرولتر عن طريق التحكم في طول الشعيرات الدموية الزجاجية.</li>
	<li>استخدم المجهر لتحديد موقع bregma و lambda وتعيين نقطة الإحداثيات (AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20) على حقنة 10 ميكرولتر (الشكل 1). تعتمد نقطة الإحداثيات على الأطلس التجسيمي لدماغ الفأر15.</li>
	<li>حفر ثقب صغير في الجمجمة عند نقطة الإحداثيات المعدلة. ملاحظة: تحت المجهر ، يتم إجراء الحفر باستخدام مثقاب دقيق معقم على سطح الجمجمة. بعد الحفر ، عن طريق إزالة السحايا التي تغطي الدماغ وكشف حمة الدماغ الكامنة ، يتم منع إصابة الأوعية الدموية. تمنع هذه الخطوة طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من الكسر بواسطة السحايا. يجب أن يكون قطر الثقب المحفور كافيا للسماح لطرف الإبرة بدخول أنسجة المخ.</li>
	<li>تطبيق 2 ميكرولتر من فيروس AAV2 / 5-A2AR-shRNA في بطين الدماغ عن طريق الحقن الجانبي بمعدل ثابت 100 nL / دقيقة. احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الانسحاب. لاحظ أن الفيروس كان يدار عن طريق الحقن من جانب واحد.</li>
	<li>أغلق الجلد المصاب باستخدام غراء البيوفيبرين الطبي على الفور لمنع فقدان الفيروس ، والذي يمكن شطفه باستخدام السائل الدماغي الشوكي بعد إزالة الإبرة إذا لم يتم تطبيق الغراء بسرعة. أيضا ، لا تستخدم أعواد القطن لمسح السائل الدماغي النخاعي ، لأنها قد تسبب أيضا فقدان الفيروس.</li>
	<li>لتسهيل الشفاء ، ضع الماوس على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.0 ± 0.5 درجة مئوية ، وقم بتطبيق 1٪ ليدوكائين موضعيا على فروة رأس الفأر. اسمح للفئران بالتعافي لمدة أسبوعين قبل تحفيز نموذج EAE ، لأن هذه الفترة ضرورية لتعبير فيروس AAV2 / 5-A 2A R-shRNA وضربة قاضية A2AR اللاحقة.</li>
</ol>3. ضربة قاضية خاصة ب ChP ل A2AR مع Cre / locus لنظام X-overP1 (Cre / LoxP)
ملاحظة: يمكن تحقيق الإجراءات التالية باستخدام الطريقة الموضحة سابقا. راجع الخطوات 2.1-2.11 للحصول على طرق الحقن التفصيلية.
<ol><li>حقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل بطين جانبي لفأر Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato كمجموعة تجريبية و 2 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) كمجموعة ضابطة. باستخدام نفس البروتوكول المذكور أعلاه (القسم 2) ، قم بحقن 2 ميكرولتر من CRE-TAT recombinase في كل من البطينين الجانبيين للفئرانA 2AR flox/ flox جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من PBS المعقمة كمجموعة تحكم.</li>
	<li>تحضير أقسام الأنسجة المجمدة وإجراء تلطيخ نووي بعد 2 أسابيع من حقن CRE-TAT recombinase. راجع الخطوات 4.1-4.3 للحصول على مزيد من المعلومات.</li>
</ol>4. التروية عبر القلب في الفئران
<ol><li>تطبيق 60-80 ملغ/ كغ من صوديوم بنتوباربيتال لتخدير الفئران بعمق. قم بتأكيد مستوى التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم وقم بإجراء التروية عبر القلب باستخدام 40 مل من محلول PBS المعقم متبوعا ب 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). ملاحظة: يشار إلى التروية الناجحة باللون الأبيض في الكبد ، في حين أن وجود رئتين متضخمتين أو تدفق PBS من الفم أثناء التروية يشير إلى فشل الإجراء.</li>
	<li>استخراج دماغ الفأر بسرعة ، وضمان الحد الأدنى من تدهور البروتين.</li>
	<li>اغمر دماغ الفأر في 4٪ PFA / PBS طوال الليل لما بعد التثبيت ، متبوعا بالاستبدال بمحلول 30٪ سكروز PB لمدة 72 ساعة. ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب الجفاف المفرط لأنسجة المخ ، لذلك لا ينبغي ترك الدماغ في محلول السكروز PB لفترة طويلة.</li>
</ol>5. تقسيم الأنسجة المجمدة وتلطيخها
<ol><li>قم بتضمين دماغ الفأر المجفف سابقا في غراء درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميد الدماغ المضمن ، واستخدم ميكروتوم منزلق لقطع المقاطع الإكليلية بسمك 20 ميكرومتر.</li>
	<li>ضع أقسام الدماغ على الشريحة الزجاجية. بمجرد أن تجف أقسام الدماغ ، قم بتخزينها في ثلاجة -20 درجة مئوية لإجراء تجارب لاحقة.</li>
	<li>ضع كل شريحة زجاجية في علبة إطار واغمر الإطار في وعاء مملوء ب PBS لشطف الشريحة جيدا. شطف بلطف شرائح الدماغ مع حل PBS ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة. ملاحظة: يجب توخي الحذر لمنع أقسام الدماغ من السقوط من الشريحة الزجاجية.</li>
	<li>قم بتلطيخ شرائح الدماغ بمحلول 4 ′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>شطف شرائح الدماغ بمحلول PBS لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>ضع قطرة واحدة من وسيط تركيب مضاد التلاشي على أقسام الدماغ.</li>
	<li>ضع غطاء على أقسام الدماغ ، وأغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر ، وحلل الأقسام باستخدام مجهر مضان تقليدي.</li>
</ol>6. تحريض EAE
ملاحظة: إجراء تحريض EAE بعد أسبوعين من حقن shRNA أو CRE-TATrecombinase 11.
<ol><li>قم بإنشاء محلول مائي عن طريق خلط 2.5 ملغ من البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG35-55) مع 2 مل من PBS. قم بإعداد محلول زيت فرويندز المساعد (CFA) الكامل عن طريق خلط المتفطرة السلية (H37Ra) مع مساعد فرويندز غير المكتمل (IFA).</li>
	<li>امزج المحاليل المائية والزيتية بنسبة 1: 1. استخدم أنبوب الإنطلاق لخفق الخليط في حالة الزيت في الماء. ملاحظة: يسمى أنبوب نقطة الإنطلاق أيضا أنبوبا ثلاثي الاتجاهات. إنه أنبوب بلاستيكي يمكنه التحكم في اتجاه المحلول المتدفق لخلط MOG35-55 و CFA بالكامل.</li>
	<li>استخدم خالط عالي السرعة لصنع مستحلب مستضد MOG لنموذج EAE في ظل ظروف حمام الجليد.</li>
	<li>تخدير الفئران داخل الصفاق ب 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 6-8 مل / كجم تعادل 60-80 مجم / كجم بنتوباربيتال.</li>
	<li>حقن مستحلب مستضد MOG تحت الجلد في أربع نقاط مختلفة (الرقبة والظهر والوركين الأيسر والأيمن) بحجم 10 مل / كجم لما مجموعه أربع حقن لكل منهما. ملاحظة: من المهم اختيار موقع الحقن بعناية ، حيث قد يكون للمواقع المختلفة تأثيرات متفاوتة على مراضة الفئران ووفياتها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي حقن MOG المتكررة إلى تحمل المناعة ، لذلك اختار فريق البحث طريقة حقن واحدة لمنع هذه المشكلة المحتملة.</li>
	<li>يحقن فورا 500 نانوغرام/مل من سم السعال الديكي (PT) داخل الصفاق بجرعة 5 ملغ/كغ بعد حقن MOG. ملاحظة: يزيد PT من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ويسهل تسلل الخلايا التائية إلى الدماغ.</li>
	<li>بعد 48 ساعة ، قم بحقن محلول PT داخل الصفاق بنفس الحجم.</li>
</ol>7. درجة العجز العصبي
<ol><li>تقييم وتصنيف الفئران يوميا باستخدام مقياس تصنيف 16 يتراوح من 0 إلى15 لتقييم حدوث وشدة EAE وفقا للعجز العصبي التالي: الذيل: 0 يشير إلى عدم وجود علامات ، 1 يمثل ذيلا نصف مشلول ، و 2 يشير إلى ذيل مشلول تماما. الأطراف: 0 تشير إلى عدم وجود علامات ، 1 تمثل مشية ضعيفة أو متغيرة ، 2 تشير إلى شلل جزئي ، و 3 تمثل طرفا مشلولا تماما.</li>
	<li>تعيين مصاب بالشلل الرباعي المصاب بالشلل التام بدرجة 12 ، وتعيين معدل وفيات بدرجة 15.</li>
</ol>8. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H&E)
<ol><li>خذ دماغ الفأر المجفف وقم بتضمينه في البارافين المنصهر. اترك كتلة البارافين لتبرد وتتصلب لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: يجب أن تكون كتلة البارافين جافة تماما وباردة لتجنب تلف الأنسجة.</li>
	<li>قطع كتلة البارافين الدماغ الفأر إلى شرائح 5 ميكرومتر. ضع قسم دماغ فأر البارافين على شريحة زجاجية وجففه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.</li>
	<li>اغمر الشرائح بالتتابع في محلول الزيلين I لمدة 10 دقائق ، ومحلول الزيلين II لمدة 10 دقائق ، والكحول 100٪ I لمدة 3 دقائق ، والكحول 100٪ II لمدة 3 دقائق ، والكحول 95٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول 90٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 80٪ لمدة 3 دقائق ، والكحول بنسبة 70٪ لمدة 3 دقائق ، والماء المقطر لمدة 1 دقيقة.</li>
</ol>9. تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)
<ol><li>بعد تعطير الفئران مع PBS ، قم بإزالة ChP من البطينين واستخراج الحمض النووي الريبي مع Trizol. توليف cDNA باستخدام أول مجموعة توليف cDNA ستراند.</li>
	<li>قم بإجراء تحليل qPCR باستخدام بريمكس Ex Taq SYBR-green ونظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. استخدم البادئاتA 2AR التالية: إلى الأمام - GCCATCCCATTCGCCATCA ؛ عكس - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

إسكات الجينات الانتقائي في الضفيرة المشيمية

<ol>
	<li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus.">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus:+biology+and+pathology.">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li><li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease.">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component.">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells.">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li><li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function.">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development.">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).</li><li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity.">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).</li><li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation.">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus.">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery.">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li><li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li><li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+elevated+matrix+metalloproteinase+(MMP)+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1/Th2+polarization.">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li><li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress.">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li><li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE.">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li><li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE.">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li><li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae:+MMP-2,+ICAM-1,+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target.">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li><li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).</li></ol>

ويذكر صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة أو إفصاحات أخرى يعلنان عنها.

قدم البحث نهجين متميزين للضربة القاضية المستهدفة لجينات ChP. تضمن النهج الأول حقن ICV ل CRE-TAT ، الذي يحتوي على Cre recombinase ، في الفئرانA 2AR flox/ flox. أما النهج الثاني فينطوي على حقن القيمة المحلية ل AAV2/5 الذي يحمل الحمض النووي الريبوزي الريبي منA 2AR. من خلال استخدام هاتين الاستراتيجيتي...

غالبا ما كان يعتقد أن الضفيرة المشيمية (ChP) تساعد في الحفاظ على التوازن الوظيفي للدماغ عن طريق إفراز السائل النخاعي (CSF) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) 1,2. كشفت الأبحاث المتزايدة على مدى العقود الثلاثة الماضية أن ChP يمثل مسارا متميزا لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS).
تحافظ الوصلات الضيقة (TJs) ل ChP ، المكونة من ظهارة ChP أحادية الطبقة ، على التوازن المناعي عن طريق منع الجزيئات الكبيرة والخلايا المناعية من دخول الدماغ3. ومع ذلك ، في ظل ظروف مرضية معينة ، يكتشف نسيج ChP ويستجيب للأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) في السائل الدماغي النخاعي والدم ، مما يؤدي إلى تسلل مناعي غير طبيعي وخلل وظيفي في الدماغ 4,5. على الرغم من دوره الحاسم ، فإن صغر حجم ChP وموقعه الفريد في الدماغ يجعل من الصعب دراسة وظيفته دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى. لذلك ، فإن معالجة التعبير الجيني على وجه التحديد في ChP هو نهج مثالي لفهم وظيفته.
في البداية ، كانت الخطوط المعدلة وراثيا لإنزيم إعادة التركيب الدائري (Cre) ، والتي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بالجينات المعبر عنها في ChP ، تستخدم بشكل شائع لحذف الجينات المستهدفة عن طريق التكاثر بجينات مرشحة متخبطة6،7،8. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن عامل النسخ Forkhead box J1 (FoxJ1) حصريا في ظهارة ChP لدماغ الفأرقبل الولادة 7. وهكذا ، غالبا ما تم استخدام خط FoxJ1-Cre لحذف الجينات الموجودة في ChP 6,9. ومع ذلك ، فإن نجاح هذه الاستراتيجية يعتمد بشكل كبير على خصوصية المروج. تم اكتشاف تدريجيا أن نمط تعبير FoxJ1 لم يكن مميزا بما فيه الكفاية ، حيث كان FoxJ1 موجودا أيضا في الخلايا الظهارية الهدبية في أجزاء أخرى من الدماغ والجهاز المحيطي7. للتغلب على هذا القيد ، تم إجراء حقن داخل الدماغ البطيني (ICV) من Cre recombinase لتوصيل recombinase إلى البطينين من الخطوط المعدلة وراثيا floxed. أظهرت هذه الاستراتيجية خصوصية عالية ، كما يتضح من وجود مضان tdTomato فقط في أنسجة ChP10,11. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة محدودة بسبب توفر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدم الباحثون حقن ICV للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP أو الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة12,13. كشف تقييم شامل للأنماط المصلية المختلفة لعدوى AAV لعدوى ChP أن AAV2 / 5 و AAV2 / 8 يظهران قدرات عدوى قوية في ChP ، بينما لا يصيبان مناطق الدماغ الأخرى. ومع ذلك ، وجد أن AAV2 / 8 يصيب البطانة العصبية المحيطة بالبطينين ، في حين أن مجموعة AAV2 / 5 لم تظهر أي عدوى14. هذه الطريقة لها ميزة التغلب على قيود الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا.
توضح هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لضربة قاضية للجين في ChP باستخدام طريقتين: ICV ل AAV2 / 5 الذي يحمل shRNA لمستقبل الأدينوزين A 2A (A 2A R) وبروتين Cre recombinase الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT) RECOMBINASE لتحقيق ضربة قاضية خاصة ب ChP لA 2A R. تشير نتائج الدراسة إلى أن هدمA 2AR في ChP يمكن أن يخفف من التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). يوفر هذا البروتوكول التفصيلي إرشادات مفيدة لدراسات وظائف ChP والضربة القاضية المحددة للجينات في ChP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2ARflox/flox mice</td>
			<td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2/5-A2AR-ShRNA virus</td>
			<td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td>
			<td>pt-4828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary</td>
			<td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD, Shenzhen</td>
			<td>69100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRE-TAT recombinase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Absin</td>
			<td>B25A031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen slicing machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra</td>
			<td>Becton Dickinson and company</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, American</td>
			<td>P/N:&#160;86259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freunds adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55</td>
			<td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>4010006243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT glue</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>6502p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Boyun Biotech</td>
			<td>PC13003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N45014F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>&#160;6110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real- Time PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>CFX96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super high speed homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene solution</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted knockdown of genes in the choroid plexus

تعمل الضفيرة المشيمية (ChP) كبوابة حرجة لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تنظيم نشاط ChP قد يوفر الحماية ضد اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن دراسة الوظيفة البيولوجية ل ChP دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى أمر صعب بسبب هيكله الدقيق. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لضربة قاضية للجينات في أنسجة ChP باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) أو بروتين إعادة التركيب الدائري (Cre) الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT). تظهر النتائج أنه بعد حقن AAV أو CRE-TAT في البطين الجانبي ، كان التألق يتركز حصريا في ChP. باستخدام هذا النهج ، نجحت الدراسة في إسقاط مستقبل الأدينوزين A 2A (A2A R) في ChP باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو Cre / locus لأنظمة X-overP1 (Cre / LoxP) ، وأظهرت أن هذه الضربة القاضية يمكن أن تخفف من أمراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة على الأبحاث المستقبلية حول دور ChP في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.

The choroid plexus (ChP) was often thought to help maintain brain functional homeostasis by secreting cerebrospinal fluid (CSF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)1,2. Increasing research over the last three decades has revealed that the ChP represents a distinct pathway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS).
The tight junctions (TJs) of the ChP, composed of a monolayer ChP epithelium, maintain immunological homeostasis by preventing macromolecules and immune cells from entering the brain3. However, under certain pathological conditions, the ChP tissue detects and responds to danger-associated molecular patterns (DAMPs) in the CSF and blood, leading to abnormal immune infiltration and brain dysfunction4,5. Despite its critical role, the ChP&#39;s small size and unique location in the brain make it difficult to study its function without affecting other brain regions. Therefore, manipulating gene expression specifically in the ChP is an ideal approach to understanding its function.
Initially, cyclization recombination enzyme (Cre) transgenic lines, which express Cre under the control of promoters specific to genes expressed in the ChP, were commonly used to delete target genes by breeding with floxed candidate genes6,7,8. For example, the transcription factor Forkhead box J1 (FoxJ1) is exclusively expressed in the ChP epithelium of the prenatal mouse brain7. Thus, the FoxJ1-Cre line was often used to delete genes located in the ChP6,9. However, the success of this strategy relies heavily on the specificity of the promoter. It was gradually discovered that the FoxJ1 expression pattern was not distinctive enough, as FoxJ1 was also present in ciliated epithelial cells in other parts of the brain and peripheral system7. To overcome this limitation, intra-cerebroventricular (ICV) injection of Cre recombinase was performed to deliver recombinase into the ventricles of floxed transgenic lines. This strategy showed high specificity, as evidenced by the presence of tdTomato fluorescence solely in the ChP tissue10,11. However, this method is still limited by the availability of floxed transgenic mouse lines. To address this issue, researchers have employed ICV injection of adeno-associated virus (AAV) to achieve ChP-specific knockdown or the overexpression of target genes12,13. A comprehensive evaluation of different AAV serotypes for ChP infection revealed that AAV2/5 and AAV2/8 exhibit strong infection abilities in the ChP, while not infecting other brain regions. However, AAV2/8 was found to infect the ependyma surrounding ventricles, whereas the AAV2/5 group showed no infection14. This method has the advantage of overcoming the limitations of acquiring floxed transgenic animals.
This article describes a step-by-step protocol for gene knockdown in the ChP using two methods: ICV of AAV2/5 carrying shRNA of the adenosine A2A receptor (A2AR) and Cre recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT) recombinase to achieve ChP-specific knockdown of A2AR. The study findings suggest that knocking down A2AR in the ChP can alleviate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This detailed protocol provides useful guidance for ChP function studies and the specific knockdown of genes in the ChP.

تسليط الضوء على المؤلف: رؤى وابتكارات في تقنيات معالجة التعبير الجيني لأبحاث الضفيرة المشيمية 

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

The objective of this research is to investigate the techniques for manipulating gene expression in the choroid plexus. Our study has introduced the two methods that allow for technique exclusively in the choroid plexus without any discernible impact on other regions. Our findings can potentially enhance future function studies of the choroid plexus in neuroscience.Our research has reviewed that inhibiting T-cell infiltration across the choroid plexus through selective lockdown of adenosine to a receptor is sufficient to protect mice from EAE pathology. This finding supports the notion that detecting gateway activity in the choroid plexus could present a promising new strategy for treating multiple sclerosis. This study presents two alternative methods for gene expression manipulation in the choroid plexus.ICV injection of Cre recombinase into those transgenic mice or ICV injection of AAV2/5, or it's targeted SHI in the WT mice. These methods overcome issues with promoting specificity and transgenetic mouse breeding.

ضربة قاضية A2AR خاصة ب ChP عن طريق حقن ICV ل AAV2 / 5-shRNA أو CRE-TAT لا يزال دور A2AR في ChP كمنظم قوي للمعلومات العصبية في التسبب في EAE غير واضح. يمكن أن يؤدي هدم تعبير A 2A R الخاص ب ChP إلى إلقاء الضوء على التأثيرات التنظيمية A2AR على الجهاز المناعي المركزي في EAE والتهابات الجهاز العص?...

Watch this Scientific Journal Video about Insights and Innovations in Gene Expression Manipulation Techniques for Choroid Plexus Research at JoVE.com

هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

الهدف من هذا البحث هو التحقيق في تقنيات التلاعب بالتعبير الجيني في الضفيرة المشيمية. قدمت دراستنا الطريقتين اللتين تسمحان بالتقنية حصريا في الضفيرة المشيمية دون أي تأثير ملحوظ على المناطق الأخرى. يمكن أن تعزز النتائج التي توصلنا إليها الدراسات الوظيفية المستقبلية للضفيرة المشيمية في علم الأعصاب.استعرض بحثنا أن تثبيط تسلل الخلايا التائية عبر الضفيرة المشيمية من خلال الإغلاق الانتقائي للأدينوزين إلى مستقبل كاف لحماية الفئران من أمراض EAE. تدعم هذه النتيجة فكرة أن اكتشاف نشاط البوابة في الضفيرة المشيمية يمكن أن يقدم استراتيجية جديدة واعدة لعلاج التصلب المتعدد. تقدم هذه الدراسة طريقتين بديلتين لمعالجة التعبير الجيني في الضفيرة المشيمية.حقن ICV من Cre recombinase في تلك الفئران المعدلة وراثيا أو حقن ICV من AAV2 / 5 ، أو أنه يستهدف SHI في الفئران WT. تتغلب هذه الطرق على المشكلات المتعلقة بتعزيز الخصوصية وتربية الفئران عبر الجينات.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

691 Views.  Wenzhou Medical University. الهدف من هذا البحث هو التحقيق في تقنيات التلاعب بالتعبير الجيني في الضفيرة المشيمية. قدمت دراستنا الطريقتين اللتين تسمحان بالتقنية حصريا في الضفيرة المشيمية دون أي تأثير ملحوظ على المناطق الأخرى. يمكن أن تعزز النتائج التي توصلنا إليها الدراسات الوظيفية المستقبلية للضفير...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: رؤى وابتكارات في تقنيات معالجة التعبير الجيني لأبحاث الضفيرة المشيمية 

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System  

To begin, place the anesthetized mice on the surgical platform. After trimming the hair, apply eye ointment down both eyes to prevent them from drying. Then fix the mice onto a stereotaxic apparatus for immobilization.Make a small incision under a microscope to fully expose the skull. Prepare two 10 microliter syringes, one containing AAV2/5-adenosine 2A receptor shRNA, and the other containing AAV2/5 scramble. Then use the microscope to locate the bregma and lambda and set the coordinate point on the 10 microliter syringe based on the mouse brain stereotaxic atlas.Drill a small hole in the skull at the established coordinate point. Inject two microliters of AAV2/5-Adenosine 2A receptor shRNA virus into the brain ventricle via lateral injection at a steady rate of 100 nanoliters per minute. Keep the needle in place for 10 minutes before withdrawing.Seal the injured skin promptly using medical bio fibrin glue to prevent virus loss. Place the mouse on a heating pad, maintaining its body temperature approximately at 37 degrees Celsius to facilitate recovery. Inject two microliters of CRE-TAT Recombinase into each lateral ventricle of Arosa L-D-L-T-D tomato mouse for the experimental group, and two microliters of sterile PBS for the control group.Two weeks after the CRE-TAT Recombinase injection, prepare frozen tissue sections, perform nuclear staining and prepare the slide for imaging Knocking down adenosine 2A receptor in the choroid plexus in homozygous adenosine 2A receptor fluxed mouse, using CRE-TAT, led to decreased EAE clinical scores. Similarly, knocking down choroid plexus in adenosine 2A receptor wild-type mice, using AAV2/5 shRNA decreased EAE clinical scores. The QPCR analysis showed that the mRNA levels of adenosine 2A receptor decreased in the AAV2/5 shRNA and CRE-TAT groups, compared to each control.Silencing adenosine 2A receptor, specifically in the choroid plexus, reduced immune cell infiltration into the spinal cord.