Este protocolo tiene como objetivo obtener altas cantidades de macrófagos no estimulados que se han derivado de la médula ósea y que nunca han estado expuestos a factores tisulares o citoquinas. La principal ventaja de esta técnica es el número de células adquiridas de un solo animal. Con el procedimiento correcto, se puede obtener aproximadamente 2 veces 10 elevado a 7 macrófagos.
Este método podría ayudar a los investigadores de diferentes áreas que estudian los macrófagos, como la biología celular, la patología, la inmunología y la parasitología, ya que debido a que las células siempre son susceptibles a la contaminación, es necesario tener cuidado con todos los pasos estériles y utilizar una cabina de bioseguridad de flujo laminar para mantener la viabilidad celular. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Izabela Aparecida de Souza. Un estudiante de maestría de nuestro laboratorio.
Para comenzar el procedimiento en el ratón macho de tipo salvaje C57BL/6 de ocho semanas de edad debidamente sacrificado, empape el ratón con una solución de etanol al 70%. Con unas tijeras estériles, haga una incisión de un centímetro a lo largo del abdomen y retire la piel hasta que el músculo de las patas traseras quede completamente expuesto. A continuación, retire con cuidado las patas traseras a la altura de la cadera sin romper el fémur y la tibia.
Coloque las patas traseras intactas en un tubo de centrífuga cónico que contenga una solución de etanol al 70%. Dentro de una cabina de bioseguridad de flujo laminar, transfiera las patas aisladas de etanol al 70% a PBS estéril. Con fórceps y toallitas desinfectantes, limpie los huesos eliminando todos los músculos adheridos y la fascia.
A continuación, utilice una hoja de bisturí quirúrgico estéril para cortar la epífisis ósea en ambos extremos, exponiendo la médula ósea. Llene una jeringa de 20 mililitros con 10 mililitros de PBS estéril suplementado con una solución de estreptomicina de penicilina al 2% y conecte una aguja de calibre 26 a ella. Sostenga el hueso con pinzas de disección anatómica con una mano.
Use la otra mano para insertar la aguja en la cavidad ósea con cuidado sin aplastar el hueso. A continuación, lave el interior del hueso con PBS y recoja la médula ósea en un tubo centrífugo cónico estéril. Una vez lavada, la cavidad ósea debe aparecer blanca.
Centrifugar las células recolectadas a 300 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de medio DMEM/F1210. Homogeneizar la suspensión y añadir otros nueve mililitros del medio para subir el volumen total a 10 mililitros.
Agregue un mililitro de la suspensión de la célula progenitora en cada una de las 10 placas de Petri de plástico redondas, que miden 100 mililitros por 20 milímetros. Extienda las células a través de las placas con una pipeta para obtener una distribución uniforme. A continuación, añadir nueve mililitros de DMEM/F1210 suplementado con un 20% de sobrenadante celular L929 a cada plato.
Incubar los platos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al tercer día, añadir 10 mililitros de medio DMEM/F1210 suplementado con un 20% de sobrenadante celular L929 a cada placa. Los 20 mililitros de medio de cultivo resultantes en cada placa son suficientes para el crecimiento celular hasta la maduración.
Deseche los sobrenadantes de todos los platos de cultivo. Lave cada placa de cultivo con 10 mililitros de PBS estéril libre de magnesio y calcio, precalentado a 37 grados centígrados, y deseche la solución después del lavado. Agregue tres mililitros de solución de disociación celular no enzimática, precalentada a 37 grados Celsius a cada plato.
Incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, utilice un microscopio invertido para visualizar si los macrófagos se disocian de las placas de cultivo celular. Con una pipeta serológica, lavar los platos con la solución de disociación celular no enzimática repetidamente realizando movimientos circulares para asegurar la disociación completa de los macrófagos.
Recoja y combine la solución de todas las placas de cultivo en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros. Una vez más, agregue 10 mililitros de PBS estéril y precalentado a los platos de cultivo vacíos. Centrifugar el tubo cónico que contiene la solución combinada recolectada a 300 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con un mililitro de DMEM/F1210. Homogeneice la suspensión lenta y cuidadosamente pipeteándola hacia arriba y hacia abajo sin dañar las células. Diluir una alícuota de 10 microlitros de la solución de macrófagos añadiendo 10 microlitros de azul de tripán para contar las células con un hemocitómetro.
Al séptimo día, cada plato produciría aproximadamente 2 millones de macrófagos. La exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos del sobrenadante L929 transformó gradualmente los progenitores de la médula ósea en macrófagos maduros, mostrando una morfología típica dispersa debido a las extensiones citoplasmáticas. Al tercer día, han aparecido algunos macrófagos inmaduros, con una morfología típica de forma redonda con pocas proyecciones en la membrana.
Aunque se transformaron a lo largo de todo el proceso, fueron necesarios siete días para alcanzar un número y madurez adecuados. Los macrófagos obtenidos mostraron una población homogénea en términos de tamaño y granularidad en el análisis de citometría de flujo. Además, el 100% de la población expresó las moléculas de superficie características F480 y CD11B, formando una única población bien definida de células.
La capacidad de fagocitosis de los macrófagos maduros y bien diferenciados se confirmó mediante imágenes de microscopía de fluorescencia que mostraban parásitos fagocitados de Leishmania major dentro de los macrófagos. Las patas deben retirarse del animal con cuidado porque se realiza en un ambiente no estéril y es la fuente más importante de contaminación. Las patas no deben romperse fuera de la cabina de bioseguridad de flujo laminar.
Los macrófagos derivados de la médula ósea obtenidos de este protocolo se pueden utilizar para realizar posteriormente la polarización in vitro de los macrófagos para comprender la fisiología de los macrófagos.
