Este protocolo simple permite etiquetar los vehículos eléctricos y monitorearlos a través de microscopía confocal. Por ejemplo, las imágenes EV podrían ayudar a evaluar la distribución EV cuando se usan en terapias. Esta técnica permite monitorear la migración y absorción de EV en los explantes de cartílago fácilmente, con microscopía confocal sin ninguna función especial.
El mismo protocolo se puede utilizar para vehículos eléctricos para experimentos in vitro o in vivo. Asegúrese de que las columnas estén preparadas de antemano y que el volumen inicial de vehículos eléctricos sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada, teniendo en cuenta que alrededor del 10% de las partículas se perderán durante el paso de purificación. Comience concentrando la muestra de vesícula extracelular, o EV, y el control.
Coloque las muestras en un tubo de concentración de 15 mililitros o 500 microlitros, dependiendo del volumen inicial de la muestra EV. Centrifugar los tubos según las instrucciones del fabricante hasta obtener una muestra casi seca. Vuelva a suspender las muestras concentradas de EV con 200 microlitros, y el grupo de control con 100 microlitros de diluyente C, y transfiéralas a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.
Separe la muestra EV en dos alícuotas de 100 microlitros cada una. Marque una de las alícuotas con tinte y úsela como tratamiento. Deje el otro sin marcar, pero procese como la muestra EV y úselo para cuantificar la concentración de EV mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas.
Prepare la solución de colorante 2x de tal manera que la concentración resultante de la solución de PKH26 en el diluyente C sea de ocho micromolares. Mezcle un microlitro de enlazador PKH26 milimolar por 125 microlitros de diluyente C en la muestra. Prepare el volumen necesario para agregar a las muestras en una proporción de 1:1.
Agregue 2x solución de colorante a los EV derivados del lisado plaquetario PKH y muestres de control en una proporción de 1: 1, para lograr una concentración de colorante 1x y una concentración de PKH26 micromolar. Agregue el mismo volumen de PBS a la muestra ev derivada del lisado plaquetario NTA. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Agregue una solución de albúmina-PBS sérica bovina al 5% a las muestras en una proporción de 1: 1 y asegúrese de que el volumen final sea de aproximadamente 400 microlitros. Proceda a separar los EV etiquetados del tinte no unido y las interacciones de tinte no específico con la columna. Retire la tapa de la columna, agregue 400 microlitros de EV derivados del lisado plaquetario PKH, EV derivados del lisado plaquetario NTA o controle y deseche todo el líquido eluido.
Espere a que la muestra entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso. Agregue 600 microlitros de PBS y deseche todo el líquido eluido. Espere a que el PBS ingrese la columna por completo antes de continuar con el siguiente paso.
Agregue 600 microlitros de PBS y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Para una nueva columna, repita los pasos que implican la concentración de las muestras mencionadas al principio del protocolo. Agregue 600 microlitros de vehículos eléctricos previamente eluidos a la columna y deseche el volumen eluido.
Luego agregue 400 microlitros de PBS y deseche todos los volúmenes eluidos. Agregue 600 microlitros de PBS a la columna y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Lave el cartílago dos veces con PBS y apóselo con una punción de biopsia de tres milímetros de diámetro en condiciones estériles.
Coloque los explantes en placas de cultivo de 96 pocillos con medio DMEM-F12, complementado con estreptomicina de penicilina al 1% a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y 80% de humedad. Para establecer un modelo de OA impulsado por la inflamación, complemente el medio de cultivo celular con 10 nanogramos por mililitro de oncostatina M y dos nanogramos por mililitro de factor de necrosis tumoral alfa. Tratar los explantes con 1 veces 10 a la 9ª partícula por pocillo de EV derivados del lisado plaquetario PKH, o control, en medio de cultivo celular suplementado con oncostatina M y factor de necrosis tumoral alfa.
Retire el medio de las placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen explantes de cartílago. Agregue 200 microlitros del medio de cultivo celular a cada pozo como se describe en el manuscrito. Detenga el ensayo in vitro cada hora de cero a cinco horas.
Lave los pocillos de cultivo celular que contienen los explantes de cartílago dos veces con 200 microlitros de PBS. Agregue 100 microlitros de paraformaldehído al 4% al tejido para fijarlo durante tres horas a cuatro grados centígrados. Retire el PFA, agregue 100 microlitros de PBS, almacene el tejido fijo a cuatro grados Celsius y procese las muestras dentro de las 48 horas.
Las imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo muestran cómo los EV ingresan al tejido hasta que alcanzan los condrocitos y entran en los condrocitos con el tiempo. Los EV marcados ya estaban localizados alrededor de los condrocitos después de una hora de incubación. Asegúrese de que el volumen inicial de evs sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada.
Otra cosa importante a recordar es usar los vehículos eléctricos etiquetados dentro de las próximas 24 horas. Si no lo usa dentro de las 24 horas, puede ocurrir una disminución en la fluorescencia. Esta técnica ayudará a los investigadores a mejorar las imágenes ev y a estudiar los EV en biología y terapéutica.
