Este protocolo proporciona una técnica rigurosa y reproducible para la extracción y aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares de muestras de tejido entero para análisis ex-vivo aguas abajo. Con los niveles más altos de pureza actualmente alcanzables, este método facilita la caracterización directa morfológica, inmunofenotípica y profunda de vesículas intersticiales secretadas en varios especímenes de tejido, incluyendo tumores. Aquí, demostramos el aislamiento de vehículos eléctricos de tejido de muestras de tumores cerebrales y pulmonares.
Sin embargo, esta técnica se puede aplicar a estudios que utilizan muestras de tumores diversos, benignos u otros. Para comenzar, prepare 10 mililitros de tampón de disociación en el medio Hibernate-E por cada 0,4 a 1,0 gramos de tejido. Agregue tejido fresco o congelado entero al tampón en un tubo de 50 mililitros e incubar en un baño de agua tibia a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Después de esto, añadir inhibidores de la proteasa y fosfatasa para una concentración final de 1x en el tampón de disociación. Vierta la solución con el tejido en un homogeneizador de ajustes sueltos. Utilice aproximadamente 30 golpes lentos por muestra para disociar suavemente el tejido.
A continuación, transfiera el tejido disociado y la solución tampón a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 500x g y a cuatro grados celsius durante cinco minutos para peletizar las células y las fibras restantes o fragmentos de tejido cohesivo. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mililitros, y centrifugar a 2.000 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para peletizar y desechar los desechos celulares grandes.
Transfiera este sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mililitros, y centrífuga a 10.000x g y a cuatro grados centígrados durante 40 minutos para peletizar cualquier vesícula más grande no deseada o pequeños cuerpos apoptóticos. Decantar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrómetros en un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mililitros. A continuación, ultracentrifríe la muestra a 100.000x g y a cuatro grados centígrados durante dos horas, para peletizar pequeños vehículos eléctricos.
Decantar el sobrenadante y dejar los tubos de ultracentrifugación invertidos durante cinco a 10 minutos, tocando con frecuencia para eliminar cualquier líquido residual en los lados de los tubos. A continuación, resuspender el pellet EV en 1,5 mililitros de 0,25 tampón de sacarosa molar. Cubra los tubos con Parafilm y, a continuación, vórtice los vehículos eléctricos en solución.
Mece los tubos ultracentrífugos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Y luego vórtice una vez más. Centrifugar brevemente los tubos a una velocidad inferior a 1.000x g para recuperar la suspensión líquida en la parte inferior del tubo.
Si es necesario, guarde la suspensión a cuatro grados centígrados durante la noche. En primer lugar, agregue 1,5 mililitros de 60%yoodixanol a los 1,5 mililitros del búfer de tris de sacarosa que contiene los vehículos eléctricos para crear una solución final que contenga 30%yodoxanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar la solución a fondo.
Transfiera esta solución a la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación de 5,5 mililitros. A continuación, mezcle el stock de 60%iodixanol con agua ultra pura para preparar al menos 1,5 mililitros de una solución de 20% y 10% de yodoxanol. Usando una jeringa y una aguja de calibre 18, mida 1,3 mililitros de la solución de 20% de yodoxanol y capa cuidadosamente en la parte superior del gradiente inferior.
Mantenga el bisel de la aguja en contacto con el interior del tubo, justo encima del menisco y agregue la gota de solución sabia para evitar mezclar las capas en la interfaz de densidad. Luego, capa 1.2 mililitros de la solución 10%iodixanol en la parte superior de la capa 20%, utilizando la misma técnica. Equilibre y cargue cuidadosamente los tubos de ultracentrifugación en cubos de rotor.
Establezca las velocidades de aceleración y desaceleración de un rotor de cucharón oscilante a las tasas mínimas, y centrifugar a 268.000 g y a cuatro grados centígrados durante 50 minutos. Mientras la muestra está siendo centrifugada, etiquete 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada muestra que se corresponda con las fracciones del uno al 10 del gradiente de densidad. Una vez completada la centrifugación, retire suavemente los tubos de los cubos del rotor y colóquelos en un soporte estable.
Pipeta 10 fracciones seriales de 490 microlitros desde la parte superior del gradiente hasta los tubos correspondientes. Usando un refractómetro, mida los índices de refracción de las fracciones. A continuación, transfiera cada fracción a un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mililitros.
Agregue cinco mililitros de 1x PBS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar. Agregue seis mililitros adicionales de 1x PBS a la parte superior del tubo, y mezcle cuidadosamente de nuevo. Ultracentrífaza los tubos a 100.000 g y a cuatro grados centígrados para re-pellet las vesículas pequeñas.
Decantar el sobrenadante y tocar los tubos secos antes de la lesión de las vesículas para el análisis de proteínas o reresuspending los EV para el análisis morfológico. Para anlicer los VEHÍCULOs eléctricos para el análisis de proteínas, agregue 40 microlitros de tampón de lelisis fuerte que contenga inhibidor de la proteasa a los pellets EV. Coloque Parafilm sobre cada tubo y vórtice vigorosamente.
A continuación, mece los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente y vórtice de nuevo. Centrifugar brevemente la muestra a 1.000x g durante 30 a 60 segundos para recuperar todo el volumen de la muestra. Transfiera cada muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y guárdela a una temperatura de entre 20 y 80 grados centígrados hasta que esté lista para su posterior procesamiento.
Para preparar los lysates purificados para el análisis de inmunoblot, añada 5x tampón de muestra De Laemmli a las muestras para una concentración final de 1x. Hervir la muestra a 95 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. A continuación, cargue un volumen igual de fracciones de una a 10 en un gel de página 10%SDS.
Cargue una masa igual de homogeneización de tejido. Realizar análisis de electroforesis y manchas occidentales para confirmar las proteínas EV en los lysates purificados y comparar la abundancia relativa de EV en fracciones. En este estudio, las vesículas extracelulares se extraen y purifican de todo el tejido.
Después de la ultracentrifugación del gradiente de 10 a 30%iodixanol, se puede ver una población de vehículos eléctricos ligeros migrando hasta la fracción dos, mientras que una población de vehículos eléctricos densos se puede ver migrando hasta la fracción cinco, dependiendo del tipo de tejido. Los inmunoblots representativos de las fracciones de gradiente exhiben la separación y purificación eficientes de pequeños vehículos eléctricos derivados de tumores en la fracción cinco. En particular, las muestras de tumores pulmonares parecen enriquecidas en vehículos eléctricos densos en comparación con los vehículos eléctricos ligeros que previamente se cosechaban de todo el tejido cerebral.
El análisis representativo de nanopartículas y la microscopía electrónica de vesículas derivadas de tejidos en la fracción predominante de vesículas demuestran el enriquecimiento y la preservación de vesículas enteras. Consistente con el tamaño y la estructura conocidos de los vehículos eléctricos pequeños. Los vehículos eléctricos intersticiales representan objetivos prometedores para el desarrollo de nuevos ensayos de biomarcadores diagnósticos o de pronóstico.
Esta técnica proporciona a los investigadores herramientas para la extracción y purificación de vesículas para la utilidad aguas abajo. Después de la extracción de vehículos eléctricos de tejido entero o lisiado, se puede realizar una caracterización amplia de las vesículas, incluidos los análisis proteómicos, genómicos y lipidómicos. Además, las muestras se pueden utilizar para enfoques más específicos.
Las vesículas aisladas directamente de muestras de tejido pueden proporcionar más información sobre los mecanismos de la enfermedad, incluida la génesis tumoral, y pueden proporcionar importantes herramientas de diagnóstico o pronóstico en el futuro.
