La mayoría de las afecciones de salud se pueden controlar mejor si se detectan a tiempo. Los biomarcadores disponibles en los fluidos corporales accesibles son las formas más prometedoras para la detección temprana de problemas de salud. Estamos reportando mejoras en los métodos de investigación de biomarcadores de microARN liberados a través de pequeñas vesículas extracelulares desde el cerebro humano.
Este método nos ha permitido identificar la variación en las pequeñas cargas vesicales extracelulares entre diferentes subtipos genéticos de enfermedades, como la demencia, identificar candidatos a biomarcadores de carga que podrían detectarse en fluidos periféricos y mejorar el diagnóstico temprano de la enfermedad. Por lo tanto, este protocolo equilibra la eficiencia, la accesibilidad y la pureza del producto, lo que lo hace fácilmente reproducible en diferentes entornos de laboratorio. No requiere ningún equipo especializado y las columnas preempaquetadas proporcionan consistencia.
Por lo tanto, cualquier hallazgo de biomarcadores se traducirá fácilmente en un resultado clínico deseado. Con la aprobación de nuevos fármacos modificadores de la enfermedad, el diagnóstico debe abordar estas enfermedades mucho antes de lo que es posible actualmente para maximizar el beneficio para el paciente. Métodos como este conducirán a la identificación de nuevos biomarcadores de microARN relevantes para la enfermedad, lo que puede dar lugar a una mejor gestión de la salud utilizando opciones específicas de tratamiento y atención.
Utilizaremos nuestras capacidades existentes para desarrollar métodos para identificar marcadores específicos de tejidos y tipos de células que puedan detectar biomarcadores de microARN liberados de un tipo de célula específico dentro de una mezcla heterogénea que se encuentra en los fluidos corporales. Para empezar, corta en rodajas finas 250 miligramos de tejido cerebral congelado con un bisturí esterilizado en un plato frío. Añadir dos mililitros de 75 unidades por mililitro de colagenasa tipo III en solución de hibernación al tejido.
Coloque cada muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A los cinco minutos, invierta la muestra dos veces para mezclar. A los 10 minutos, pipetee suavemente la muestra tres veces con una tira desechable de plástico de 10 mililitros.
A continuación, coloque cada muestra en hielo y añada un cóctel de inhibidores de la proteasa y un inhibidor de la fosfatasa a cada muestra. Centrifugar cada muestra de tejido cerebral a 300 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante.
Y luego centrifugarlo a 2000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora recoja el sobrenadante y fíltrelo a través de un filtro de 0,22 micrómetros. A continuación, centrifugar el filtrado a 10.000 g durante 48 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de recolectar el sobrenadante, agregue tampón de precipitación a cada muestra en una proporción de dos a uno. E incubar la muestra durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar cada muestra a 10.000 g durante 96 minutos a cuatro grados centígrados.
Y resuspender el pellet en 100 microlitros de PBS libre de vesículas extracelulares. Equilibre la cromatografía de exclusión por tamaño preparada previamente o la columna SEC a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después del equilibrio, retire el tampón conservante de la parte superior de la columna y lave la columna dos veces con 250 microlitros de PBS libre de vesículas extracelulares.
A continuación, añada el pellet resuspendido a la columna y centrifugar a 50 g durante 30 segundos. Después de desechar el flujo, agregue 180 microlitros de PBS libre de EV y centrifugue la columna a 50 G durante un minuto para permitir que las pequeñas vesículas extracelulares derivadas del cerebro eluyan. Para piar pequeñas vesículas extracelulares, diluya la muestra de vesícula extracelular pequeña aislada en una proporción igual con el tampón de lisis y extracción.
Agite la muestra diluida a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 14.000 g durante 15 minutos. Recoja el sobrenadante de proteínas y mida las concentraciones de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas.
Para realizar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya cada muestra en PBS utilizando un factor de dilución de 1 a 1000. Inyecte la muestra en el instrumento NTA. Y configure el instrumento para leer la muestra a una longitud de onda de 550 nanómetros.
Utilice la cantidad de partículas para medir la cantidad de proteína por partícula expresada en femtogramos según las directrices de MISEV. A continuación, diluya el colorante de naranja o CMO de la mascarilla celular en PBS por un factor de dilución de 1 a 1000. A continuación, diluya el colorante CMO con la pequeña muestra de vesícula extracelular utilizando un factor de dilución de 1 a 10.
E incubar la mezcla en la oscuridad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora, diluya aún más la mezcla de vesículas extracelulares pequeñas del tinte CMO usando PBS en un factor de dilución de 1 a 1000. Usando el instrumento NTA, lea el tinte CMO de cada pequeña muestra de vesícula extracelular a una longitud de onda de 550 nanómetros.
Para el seguimiento de anticuerpos fluorescentes, diluya cada tetraspan y anticuerpo fluorescente en PBS utilizando un factor de dilución de 1 a 10. A continuación, diluya cada tinte de anticuerpos con la pequeña muestra de vesícula extracelular utilizando un factor de dilución de 1 a 10. E incubar la mezcla en la oscuridad durante dos horas a cuatro grados centígrados.
A continuación, diluya la segunda mezcla de anticuerpos utilizando PBS con un factor de dilución de 1 a 1000. Lea las señales de anticuerpos fluorescentes de la pequeña muestra de vesícula extracelular a una longitud de onda de 550 nanómetros utilizando el instrumento NTA. El análisis de Western blot confirmó la presencia de los marcadores positivos CD9, CD63, CD81, Flotilla One y TSG101 en pequeñas vesículas extracelulares derivadas del cerebro, mientras que Calnexin estaba ausente, lo que indica que no había contaminación celular.
El análisis de seguimiento de nanopartículas reveló que las partículas aisladas tenían un tamaño de entre 50 y 200 nanómetros, con una concentración máxima de alrededor de 100 nanómetros. Los datos de tinción de CMO mostraron que el 52,35% de las partículas tienen una bicapa lipídica, de las cuales el 34,66% contenía CD9, el 15,49% CD63 y el 12,01% CD81.
