Para comenzar, disuelva el polvo de Nilo Red en acetona a una concentración de tres miligramos por mililitro. Incubar la solución durante 15 minutos a temperatura ambiente con mezclas periódicas. Filtre la solución con un filtro de 0,22 micrómetros una o dos veces, dependiendo de la cantidad de precipitado que quede en la solución.
A continuación, prepare la solución de trabajo diluyendo la solución madre en una proporción de uno a 500 en DPBS. Añadir 200 microlitros de la solución de trabajo a las células del EPR fijadas con paraformaldehído e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador protegiéndolo de la luz. Después de la incubación, lave las muestras dos veces con DPBS, luego agregue 200 microlitros de DPBS y guárdelas a cuatro grados centígrados.
Para la tinción con BODIPY, prepare una concentración de material de 3,8 milimolares disolviendo BODIPY en DMSO anhidro. A continuación, prepare la solución de trabajo diluyendo la solución madre en una proporción de uno a 300 en DPBS. Agregue 200 microlitros de la solución de trabajo de BODIPY a las células de EPR fijadas con paraformaldehído e incube durante la noche en un balancín a temperatura ambiente.
Al día siguiente, lave las células dos veces con DPBS y agregue 200 microlitros de DPBS antes de almacenarlas a cuatro grados centígrados. Para la inmunotinción de APOE, prepare una solución tampón combinando DPBS con 1 % de BSA, 0,5 % de Tween 20 y 0,5 % de Triton X-100. Bloquear y permeabilizar las células de EPR fijadas con paraformaldehído en 200 microlitros de solución tampón durante una hora.
Después de la incubación, agregue el anticuerpo primario APPLE diluido de uno a 100 en la solución tampón e incube durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, lave las muestras dos veces con DPBS. Luego agregue 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios diluidos de uno a 1000 durante una hora a temperatura ambiente.
Después de la incubación, lave las células dos veces con DPBS y agregue 200 microlitros de DPBS antes de almacenarlas a cuatro grados centígrados.
