Utilizando un microscopio confocal y un objetivo de 40X, cree un perfil de escaneo con los canales fluorescentes apropiados para el marcador lipídico utilizado. Después de configurar el modo de adquisición y los canales, optimice la estrategia de enfoque haciendo clic en Software Autofocus. A continuación, establezca el rango de la pila Z en 20 micras.
Después de esto, optimice los mosaicos y abra el visor para seleccionar las posiciones de los mosaicos. A continuación, utilizando un método de procesamiento de imágenes por lotes, cree proyecciones máximas de cada pila Z con el método de profundidad de enfoque ampliada. Antes de exportar las imágenes, establezca la compresión en ninguna y asegúrese de que los datos originales estén comprobados.
La imagen resultante es un TIFF de proyección máxima en escala de grises de solo el canal de fluorescencia, que expresa el marcador lipídico. Identifique las imágenes TIFF que representan Nile Red, BODIPY o APOE y muévalas a la carpeta Imágenes dentro de un directorio denominado Nile Red, BODIPY o APOE, según el método que se utilice. Abra el software de la unidad lipídica.
En la pestaña Predicción, seleccione el directorio correspondiente haciendo clic en los puntos suspensivos y navegando hasta el directorio nombrado. Confirme que la unidad lipídica ha identificado las imágenes correctamente comprobando la entrada de clase. Haga clic en Predecir para observar el progreso de la tarea y, a continuación, con la herramienta Análisis de máscara, itere a través de las máscaras generadas y proporcione un recuento cuantitativo de los depósitos de lípidos umbral de las imágenes de máscara.
La diferenciación y maduración exitosa del EPR mostró una monocapa confluente con pigmentación y morfología poligonal. Por el contrario, la diferenciación fallida mostró grupos de células moribundas. En las imágenes fluorescentes, los depósitos de rojo del Nilo y BODIPY aparecían como pequeños puntos circulares brillantes.
Un resultado negativo muestra una segmentación incorrecta de la imagen al confundir la fluorescencia de fondo con un depósito, ya sea debido a una tinción débil o a una alta intensidad de fondo. Se muestran depósitos de APOE que varían en tamaño, forma e intensidad de la señal y que requieren la optimización de los métodos de tinción e imagen para minimizar la variación.
