Este método se puede utilizar para la evaluación cuantitativa de la maduración de los sarcomeres en cardiomiocitos derivados del iPSC. Utilizando este enfoque basado en la super resolución, es posible detectar incluso alteraciones sutiles en la organización de la sarcomere, lo que no es posible con la imagen confocal convencional. Al menos tres horas antes de su uso, encienda el microscopio y lleve la muestra a temperatura ambiente.
Cuando el microscopio esté listo, agregue 300 microlitros de tampón de imágenes PALM a un pozo de células etiquetadas e inserte la diapositiva de la cámara en el soporte de la etapa del microscopio. Seleccione el objetivo de aceite 1.57 NA 100X y utilice el modo PALM en el software de imágenes y active los ajustes de TIRF. Establezca el número de fotogramas en 5.000 a 10.000, la potencia del láser UV en 0,1% y el láser 647 en 0,2% y el nivel de ganancia en 50 a 100.
Una vez establecidos todos los parámetros de adquisición, encienda la iluminación láser y seleccione una celda de destino. Para adquirir una imagen, aumente la potencia láser 647 al 100% y reduzca la ganancia a cero. Blanquee la celda de destino durante unos cinco segundos, luego aumente la ganancia a 50 e inicie la adquisición de la imagen PALM.
Para la reconstrucción de los datos PALM, al final de la adquisición, abra los datos en ImageJ y abra el plugin Thunderstorm. Seleccione ejecutar análisis en el plugin y abra el menú de configuración de la cámara. Introduzca el tamaño de píxel y la ganancia electromagnética.
En el menú de análisis de ejecución, establezca el orden B-spline en tres, la escala B-spline en dos, el umbral de intensidad máxima en stfwave. f1, el radio de ajuste a tres, el sigma inicial a 1.6, la ampliación a cinco, la frecuencia de actualización a 50, y el lateral cambia a dos, y haga clic en Aceptar. Después de la reconstrucción, seleccione sigma en el menú del histograma de trazado y utilice la herramienta rectángulo para seleccionar una región de interés, excluyendo posibles artefactos. Agregue la región de interés al filtro y agregue e incertidumbre inferior a 25 a la región de valores de interés.
En la pestaña Eliminar duplicados, introduzca un umbral de distancia de 10 nanómetros. En la pestaña de fusión, establezca la distancia máxima en 20, los fotogramas máximos por molécula en cero y los fotogramas máximos apagados en uno. En la pestaña Corrección de deriva, seleccione correlación cruzada y establezca el número de ubicaciones y la ampliación en cinco, luego guarde la imagen PALM final y exporte los datos posteriores al proceso.
Para analizar la longitud de los sarcomos, importe la imagen PALM reconstruida de interés en ImageJ y utilice la herramienta de línea para dibujar una línea entre las estructuras de sarcomere seleccionadas perpendiculares al disco Z para medir la distancia más corta entre los filamentos de actina. En el menú de análisis, seleccione el perfil de trazado y adquiera la longitud entre los dos picos. Para analizar el grosor del disco Z, convierta la imagen PALM reconstruida en una imagen en modo de ocho bits y abra el plugin Detección de Ridge.
Establezca el ancho de línea en 20, el contraste alto en 230, el contraste bajo en 10, el sigma en 0,79, el umbral inferior en 25,84 y la longitud de línea mínima en 20. Seleccione el ancho de estimación, extienda la línea y muestre los resultados, haga clic en Aceptar y utilice el ancho de línea medio de la tabla de resultados para un análisis posterior. Las células de cardiomiocitos y células neonatales derivadas de iPSC presentan un patrón similar de actinina alfa con estructuras irregulares de sarcomere desorganizado.
La evaluación cuantitativa demuestra que la longitud y el grosor de los filamentos de actinina alfa son casi idénticos entre los dos grupos de células que indican un estado de desarrollo prematuro de los cardiomiocitos derivados de iPSC. Por el contrario, los cardiomiocitos maduros adultos exhiben una red regular de sarcomere con una longitud de sarcomere ligeramente aumentada y un espesor de disco Z reducido. Una comparación de las imágenes confocales convencionales y PALM no revela ninguna diferencia significativa en la longitud de los sarcomeres.
Sin embargo, se detecta un espesor profundo reducido del disco Z cuando los cardiomiocitos iPSC se someten a imágenes PALM. Se observa una ganancia en la resolución cuando se aplica PALM, que es compatible con las gráficas de intensidad correspondientes. En particular, las estructuras de sarcomere adquiridas con un amortiguador de baja calidad parecen ser más gruesas en comparación con las estructuras capturadas en condiciones óptimas de imagen.
Esta falta de precisión de datos se debe a la reducción de las propiedades de parpadeo del fluoróforo, lo que resulta en menos fotones detectados por evento de localización. Además, la precisión de localización se reduce, lo que reduce la resolución general de la imagen PALM reconstruida. Además, la deriva de la muestra puede afectar a la localización precisa de las moléculas fluorescentes, lo que resulta en imágenes borrosas.
Para adquirir imágenes PALM adecuadas, es muy importante permitir el equilibrio térmico de todo el sistema de imágenes para evitar la deriva excesiva de la muestra durante la toma de imágenes. Después de este procedimiento, otras estructuras celulares como las mitocondrias pueden ser imágenes por PALM para adquirir parámetros adicionales de maduración de cardiomiocitos.
